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                          免疫組化冰凍切片制作技巧 
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1. 從鋒利的刀片開(kāi)始 

我發(fā)現(xiàn)使用新的鋒利的刀片時(shí)常常做出高質(zhì)量的片子。我覺(jué)得在醫(yī)療場(chǎng)合中某些盡量省錢(qián)的做法顯得有些因小失大。一般我對(duì)每位患者的標(biāo)本都使用一組新的刀片，當(dāng)片子的質(zhì)量開(kāi)始下降時(shí)，我會(huì)立刻更換刀片。某些組織如質(zhì)地較硬的膠原和鈣化組織會(huì)使刀片很快變鈍，因此，經(jīng)常更換刀片顯得很有必要，有時(shí)候我在切片過(guò)程中要連續(xù)更換 2-3 次刀片。

2. 坐著還是站著 

我切片時(shí)總是坐在一張凳子上。要學(xué)會(huì)把刷子作為一種便捷的輔助工具來(lái)操作，從而精細(xì)地控制顯微厚薄程度的片子。切片時(shí)俯身彎腰，頸部過(guò)伸的姿勢(shì)有些不妥，要盡量處于放松和舒適的姿勢(shì)以便能zui大程度控制你的左手。

3. 刷子 

我是一位刷子的使用者。我相信要想切好片子首先學(xué)會(huì)使用刷子。刷子的作用就在于粘住片子并把片子弄到臺(tái)子上。冷凍的片子會(huì)自發(fā)的卷縮并從刷子上脫離下來(lái)，因此，我使用一把有硬毛、夾取面寬的刷子。我發(fā)現(xiàn)來(lái)自中國(guó)的野豬毛十分堅(jiān)硬，非常管用。你可以花 3 美元從工藝店買一把 1/4 英寸長(zhǎng)的#2 號(hào)扁平無(wú)色的刷子，把毛削成一個(gè)角度。由于是個(gè)有角的頭端，加上握持刷子成一定的角度，這樣刷子與組織接觸時(shí)就會(huì)象掃帚一樣的平。我不能理解為什么有人使用脆弱的駱駝毛刷子，組織片很容易從這些柔軟的毛上掉下來(lái)。

4. 握持刷子 

左手象拿筆一樣握持刷子，將第五指輕壓于臺(tái)面上以穩(wěn)定握筆的手 (或根據(jù)手和切片機(jī)尺寸的大小置于你感覺(jué)合適的地方)，這樣可以保證操作者動(dòng)作的靈活及可控性。我把刷子削成一個(gè)角度，大致與左手握持刷子的角度相同，這樣使刷子平著接觸組織的 1/4。

5. 搖柄的旋轉(zhuǎn) 

以連續(xù)均勻的力量轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)的搖柄，且要毫不猶豫。我看到很多冰凍切片者手握著刷子在開(kāi)始切片時(shí)總要停一下，緩慢的抓取組織，然后再開(kāi)始轉(zhuǎn)動(dòng)搖柄。依我的經(jīng)驗(yàn)看來(lái)，這種動(dòng)作增加了起始切片假象的可能，會(huì)使片子的厚度不均勻，也增加了處理脂肪類組織的難度。我切片時(shí)，象前面所說(shuō)的那樣手握刷子，以一種連續(xù)的動(dòng)作抓取組織，這個(gè)動(dòng)作與刀片接觸組織同時(shí)開(kāi)始并貫穿于整個(gè)過(guò)程。

6. 刷子的移動(dòng) 

組織塊移向刀片時(shí)刷子也要同步地向下移動(dòng)，當(dāng)組織塊剛好接觸刀片時(shí)刷子輕輕停在其底部 2 mm 處并迅速抽離。正是刷子的向下移動(dòng)使你能連續(xù)地抓取組織，當(dāng)開(kāi)始的幾毫米組織穿過(guò)刀片時(shí)便有自發(fā)卷曲的現(xiàn)象，這時(shí)，運(yùn)動(dòng)中的刷子立刻粘住其游離的邊緣部分并水平地拖向切片者。刷子的運(yùn)動(dòng)路徑是一個(gè)朝下的「肘」形，然后再朝向你自己，連續(xù)不斷。但要注意有時(shí)候把組織壓向臺(tái)面時(shí)會(huì)使組織粘在臺(tái)面上，可能會(huì)導(dǎo)致碎片，應(yīng)盡量避免。當(dāng)然預(yù)先將組織包埋起來(lái)可以使刷子不用接觸到組織，切片也容易多了。

7. 貼片 

可以從切片機(jī)的臺(tái)面上也可直接從組織塊面粘貼組織片，我一般采用前者。片子切好后，手持玻片在片子上方，向下以一個(gè)角度粘住片子的一角，在靜電作用下片子會(huì)吸附在玻片上并迅速融化。當(dāng)然在周圍涂一些包埋物對(duì)貼片有利，這種多余的包埋物可以保護(hù)片子的邊緣免受皺縮的損壞。有時(shí)候碰到貼片困難，我會(huì)在切到zui后2 mm 包埋物的時(shí)候停下來(lái)，讓片子留在組織塊上，然后倒轉(zhuǎn)搖柄，使組織塊退離刀片，再用刷子從邊緣把組織片攤平，這樣就可以從組織塊面貼片了，這對(duì)卷曲的片子或者脂肪組織非常管用。

8. 快速固定 

我右手轉(zhuǎn)動(dòng)搖柄也同時(shí)拿著玻片，片子一切好，立刻粘起片子并將它浸沒(méi)于固定液中。固定液需置于方便夠到的地方，我一般將染色架放在染色缸的旁邊，先將片子置于 95% 的乙醇溶液中固定，然后插于染色架上。如果組織固定延遲會(huì)出現(xiàn)風(fēng)干的假象，我的經(jīng)驗(yàn)是組織片還在切片機(jī)的臺(tái)面時(shí)，風(fēng)干效應(yīng)很小，當(dāng)組織片粘在有溫度的玻片上時(shí)就會(huì)出現(xiàn)明顯的風(fēng)干假象，表現(xiàn)為核的細(xì)節(jié)丟失及胞漿液的溢出。下面幾張圖片是延遲 15 秒固定和立刻固定的相同組織的比較，差異非常明顯。

9. 切片的厚度 

對(duì)于一般的手術(shù)病理我推薦切 6um 厚，這種厚度使染色更加飽滿，層次清晰，病理學(xué)家通常在 2x 和 4x 的放大倍數(shù)下可以獲得更多的信息。太薄的片子在這種放大倍數(shù)下顯得蒼白，容易忽略一些細(xì)節(jié)。6um 的片子可以有更多的時(shí)間去避免風(fēng)干假象，也會(huì)減少冰晶所造成的細(xì)胞核空洞。當(dāng)然特殊情況下可能需要更厚或更薄的片子。

10. 為什么會(huì)掉片 

我不能確定組織片粘附到玻片的具體機(jī)制，但我相信可能與組織內(nèi)的液體與玻片發(fā)生分子交聯(lián)有關(guān)。下面我例出幾種染色過(guò)程中組織片脫落的情況：

1）本身非常干燥或過(guò)度脫水的組織；

2）組織片的周長(zhǎng)與面積比過(guò)大，象細(xì)條形的組織容易受染色缸內(nèi)液體渦旋應(yīng)力的影響而脫落，同樣包括薄的纖維囊腫及不規(guī)則的壞死組織，太厚的組織也不例外；

3）反藍(lán)用的氨水濃度太高；

4）少數(shù)情況需要使用 100% 的乙醇固定；

5）一張玻片貼多個(gè)片子時(shí)，片子周圍的包埋物相互重疊。