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       常見的染色方法包括簡(jiǎn)單染色、負(fù)染色、革蘭氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、莢膜染色。制備細(xì)菌染色片一般要經(jīng)過涂片、固定、染色、水洗、干燥等步驟，然后用顯微鏡甚至油鏡觀察。

1. 簡(jiǎn)單染色：

      不同細(xì)菌或由于觀察者所側(cè)重觀察的內(nèi)容不同，所使用的染料也有差異，但簡(jiǎn)單染色的方法是一樣的。先按照上述的制片方法制片，制成需要觀察的玻片后，使用相對(duì)應(yīng)的染料滴加到玻片上的菌膜區(qū)域，以覆蓋菌膜為準(zhǔn)。按照不同染料的要求，結(jié)合所觀察的內(nèi)容確定染色時(shí)間，染色時(shí)間到達(dá)時(shí)進(jìn)行水洗，干燥等步驟。最后得到的玻片加蓋蓋玻片即可進(jìn)行鏡檢。如有需要可以后續(xù)再進(jìn)行油封、蠟封等封片過程。

2. 負(fù)染色：

      制備觀察圖片是非常容易的，但對(duì)初學(xué)者來(lái)說(shuō)想要在玻片中找到目標(biāo)菌還是有一定難度的，因?yàn)榧?xì)菌常常無(wú)色透明且較小，所以對(duì)初學(xué)者來(lái)說(shuō)除非對(duì)光圈等進(jìn)行很精細(xì)的調(diào)節(jié)，否則很難觀察到目標(biāo)菌，因此進(jìn)行負(fù)染色就十分重要。該方法是將微生物與苯胺黑混合，再將混合物覆蓋于載玻片表面，由于這兩種天然黑色染料不能滲入微生物細(xì)胞，所以使得透明的微生物個(gè)體在黑色的背景下很容易觀察。

 

負(fù)染色法常見有兩種操作方法。

① 在一個(gè)載玻片上將微生物與異地苯胺黑混合，用另外的載玻片將混合物均勻的覆蓋于原來(lái)的載玻片上。該方法的目的是使混合物在在玻片上一邊厚一邊薄，在厚與薄中間的額區(qū)域就是最佳觀察區(qū)域。

② 用一接種環(huán)苯胺黑與微生物混合，用接種針在載玻片的中央將混合物延伸很小的區(qū)域。

3. 革蘭氏染色：

      革蘭氏染色是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，而后經(jīng)碘液進(jìn)行媒染，之后用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌媒染后的顏色不會(huì)脫去，有的可以被脫去，前者叫做革蘭氏陽(yáng)性菌，后者為革蘭氏陰性菌。為方便進(jìn)一步觀察，脫色后再用堿性蕃紅進(jìn)行復(fù)染，陽(yáng)性菌仍為紫色，陰性菌染成紅色，這就是革蘭氏染色的原理。

其步驟包括初染、媒染、脫色、復(fù)染四個(gè)步驟。

4. 芽孢染色法：

      部分細(xì)菌能產(chǎn)生內(nèi)孢子，這些孢子能抵制細(xì)菌染色液的進(jìn)入，在革蘭氏染色法涂片染色時(shí)，革蘭氏陽(yáng)性菌的芽孢呈現(xiàn)無(wú)色。雖然芽孢在革蘭氏染色片中可以看到，但在不易清晰觀察時(shí)，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢與菌體呈現(xiàn)不同顏色，便于觀察。主要的芽孢染色法有孔雀綠染色法和石碳酸復(fù)紅染色法。

5. 鞭毛染色法：

      鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，非常纖細(xì)，超出了光學(xué)顯微鏡觀察極限，因此通常情況在顯微鏡下觀察不到。通過特殊的染色技術(shù)，可以將染色液附加到鞭毛的周圍，增加它的直徑，從而能在光學(xué)顯微鏡下觀察到鞭毛。鞭毛染色一般分銀鹽法和復(fù)紅沉淀法兩種。

6. 莢膜染色：

      一般細(xì)菌的莢膜與染色劑的親和性低，但莢膜通透性高，因此染料可透過莢膜使菌體著色。一般采用負(fù)染色方法使背景和菌體之間形成一透明區(qū)，將菌體襯托出來(lái)便于觀察分辨。

 

莢膜染色步驟：加一滴6%葡萄糖水溶液在載玻片的一端，無(wú)菌操作，挑取細(xì)菌斜面上培養(yǎng)72h左右的膠質(zhì)芽孢桿菌與其混合，加1滴墨汁充分混勻，用推片法制片將菌液鋪成薄層，自然干燥，滴加1-2滴無(wú)水乙醇覆蓋涂片，固定1min，自然干燥，在已晾干的涂面上，滴加1%結(jié)晶紫染色液染色，2min后用20%的硫酸銅沖洗數(shù)次，再用自來(lái)水沖洗一次，使用擦鏡紙擦干后即可鏡檢。有莢膜的菌菌體呈紫色，背景灰黑色，莢膜不著色呈無(wú)色透明圈。

染色法在細(xì)菌的觀察、分類、鑒定中經(jīng)常用到，因此是微生物檢測(cè)人員不-可或缺的基本技能之一。

 

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