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elisa的類型有哪些
閱讀:4877 發(fā)布時(shí)間:2013-10-8我們都知道elisa的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記,elisa試驗(yàn)是一種敏感性高,特異性強(qiáng),重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。剛度完小長假,大家開始恢復(fù)正常的工作,上午,我們收到了一位自北京朋友的郵件,想要了解elisa的類型,我們公司的技術(shù)部馬上開始解決的問題,合理規(guī)范的整理出了elisa的類型并發(fā)給了那位朋友。好的事物要盒大家一起分享才對,那么現(xiàn)在上海恒遠(yuǎn)生化試劑將為大家分享elisa的類型,elisa試劑以穩(wěn)定、易保存,操作簡便,結(jié)果判斷較客觀等因素,免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域的親睞。elisa的類型也是多種多樣的,下面我們開始進(jìn)入重點(diǎn),elisa的類型有哪些。
這種測定方法中有三個(gè)必要的試劑分別是固相的抗菌素原或抗體,即“免疫吸附劑”、酶標(biāo)記的抗原或抗體,稱為"結(jié)合物"、酶反應(yīng)的底物。我們要根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件,可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。
用于臨床檢驗(yàn)的elisa主要呢有以下幾種類型:
一、雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,操作步驟如下:
1) 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2) 加受檢標(biāo)本,保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。
洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3) 加酶標(biāo)抗體,保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合
的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。
4) 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色,測知標(biāo)本中抗原的量。
在臨床檢驗(yàn)中,此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、
AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合
物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動
物。如應(yīng)用單克隆抗體,一般選擇兩個(gè)針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相
載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)
抗體一起保溫反應(yīng),作一步檢測。
在一步法測定中,當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí),過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)
抗體結(jié)合,而不再形成"夾心復(fù)合物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象,此時(shí)反應(yīng)
后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的
吸光值相同(參見1.3.2,圖1-4),如按常法測讀,所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量,這種現(xiàn)
象被稱為鉤狀效應(yīng)(hook effect),因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重
時(shí),反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常
增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時(shí),應(yīng)注意可測范圍的zui高值。用
高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。
假使在被測分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇,例如HBsAg的a決定簇,也可
用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測中應(yīng)注意亞型
問題,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個(gè)亞型,雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)
性,這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗
體,多為IgM型,能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含
有RF,它可充當(dāng)抗原成份,同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合,表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。采用
F(ab’)或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑,由于去除了Fc段,從而消除RF的干擾。雙抗體
夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)(參見6.2)。
雙抗體夾心法適用于測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小
分子單價(jià)抗原,因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。
雙抗原夾心法測抗體
反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測相應(yīng)
的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需
稀釋,可直接用于測定,因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測常采
用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,尋找合適的標(biāo)記方法。
二、間接法測抗體
間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗
體)以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法(見圖2-3)。操作步驟如下:
1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
2)加稀釋的受檢血清,保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗原抗
體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,血清中的其他成份在洗滌過程
中被洗去。
3)加酶標(biāo)抗抗體??捎妹笜?biāo)抗人Ig以檢測總抗體,但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測IgG抗
體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合,從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后,
固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。
4)加底物顯色
本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包
被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。
間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)
果,但應(yīng)盡可能予以純化,以提高試驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)
生反應(yīng)的雜質(zhì),例如以E.Coli為工程酶的重組抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能與受過
E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)??乖幸膊荒芎信c酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物
質(zhì),例如來自人血漿或人體組織的抗原,如不將其中的Ig去除,試驗(yàn)中也發(fā)生假陽性反
應(yīng)。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白,也會因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?br /> 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的
特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng),非特異IgG可直接吸附到固相載體
上,有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中,抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)
(例如牛血清蛋白)再包被一次,以封閉(blocking)固相上的空余間隙。另外,在檢
測過程中標(biāo)本須先行稀釋(1:40~1:200),以避免過高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。
三、競爭法測抗體
當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去,或不易得到足夠的純化抗原時(shí),可用此法檢測特
異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體
量越多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少,因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純
度的,可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì),直接包被不易成功,可采用捕獲包被
法,即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體,然后加入抗原,形成固相抗原。洗滌除去抗原中的
雜質(zhì),然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競爭結(jié)合反應(yīng)。競爭法測抗體有多種模式,可將標(biāo)本
和酶標(biāo)抗體與固相抗原競爭結(jié)合,抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本
與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競爭結(jié)合,洗滌后再加入酶標(biāo)抗體,與結(jié)合在固相上的
抗原反應(yīng)??笻Be的檢測一般采用此法。
四、競爭法測抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn),因此不能用雙抗體夾心法
進(jìn)行測定,可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相
抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,zui后的顯色也愈淺。
小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。
五、捕獲包被法測抗體
IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或
IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體,因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的
IgG抗體,后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人
IgM作為二抗,間接測定IgM抗體,必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理,以除去IgG的
干擾。在臨床檢驗(yàn)中測定抗體IgM時(shí)多采用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相,以捕
獲血清標(biāo)本中的IgM(其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM)。然后加入
抗原,此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對抗原的特異性抗體。再與底物作
用,呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒
(HAV)抗體的檢測模式見圖2-7。
類風(fēng)濕因子(RF)同樣能干擾捕獲包被法測定IgM抗體,導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。因此中和
IgG的間接法近來頗受青睞,用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。
2.2.7 ABS-ELISA法
ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語。親和素是一種糖蛋白,分子
量60000,每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素為小分子化合物,分子量
244。用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類型的大小分
子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物,標(biāo)記方法頗為簡便。生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性,
其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多,兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個(gè)親和素可與4個(gè)生
物素分子結(jié)合,因此如把ABS與ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素(LAB)法和橋聯(lián)親
和素-生物素(ABC)法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體(或抗原)代替原ELISA系
統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體(抗原)。在LAB中,固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng),然后再加酶
標(biāo)記的生物素以進(jìn)一步提高敏感度。在早期,親和素從蛋清中提取,這種卵親和素為堿性
糖蛋白,與聚苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng),用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的
鏈霉親和素則無此缺點(diǎn),在ELISA應(yīng)用中有替代前者的趨勢。由于ABS-ELISA較普通
ELISA多用了兩種試劑,增加了操作步驟,在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA應(yīng)用不多。
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