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如何運(yùn)用單克隆-多克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色

閱讀:1640          發(fā)布時(shí)間:2013-8-5

如何運(yùn)用單克隆-多克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色 
    在細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)中,常用單克隆或多克隆抗體。一般而言,多抗能夠提供較強(qiáng)的信號,而單抗的背景清晰。只要注意其特點(diǎn),2種抗體都可以有效地利用。
 
(一)用多克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色
    良好的多抗血清包含多種針對抗原不同表位的抗體,雖然空間競爭阻止大量抗體與抗原分子結(jié)合,但數(shù)個(gè)抗體分子的結(jié)合往往得到較強(qiáng)的信號。能夠產(chǎn)生信號強(qiáng)信號是用多抗進(jìn)行細(xì)胞染色的主要優(yōu)點(diǎn)。
    多抗血清中除了含有特異性抗體外,還含有較高濃度的無關(guān)抗體,這些抗體包括動物血清中所有的抗體成分。這些抗體是細(xì)胞染色的zui大。用多克隆抗體可以帶來令人滿意的結(jié)果,但必須仔細(xì)設(shè)立對照。這包括仔細(xì)滴定一抗,盡量減低無關(guān)抗體產(chǎn)生的信號,仔細(xì)比較對照血清的染色結(jié)果。
    即使血清來自未經(jīng)免疫的動物,在高濃度情況下,也能引起較強(qiáng)的背景色。部分原因是由于抗體的非特異性附著在經(jīng)固定后的細(xì)胞上,部分是由于血清中抗體特異性結(jié)合所致。由于這些抗體在血清中并非主要活性成分,因此可以通過稀釋抗體使其信號降低至不被檢測出的程度。第二種降低這些背景信號的方法是用丙酮干燥粉預(yù)先吸收多抗血清。第三種方法是去除血清中的非特異性抗體,利用免疫親和純化的方法可以得到適用于細(xì)胞染色的良好的抗體來源。在某些情況下,利用免疫親和法純化抗體是得到清晰染色結(jié)果的基本步驟之一。
    由于多抗血清包含的抗體通常是針對抗原的多種表位,包括不易變性的表位,因此這些抗血清在用于經(jīng)過*固定的標(biāo)本染色時(shí)效果較好,尤其是用于經(jīng)甲醛固定標(biāo)本的染色。
 
(二)用單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色
    用單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色往往得到良好結(jié)果,因?yàn)閱慰辜兌雀?、特異性?qiáng),在較寬的濃度范圍內(nèi)染色的背景色清晰。對經(jīng)有機(jī)溶劑或甲醛固定的細(xì)胞,大部分單抗可以得到較好的染色結(jié)果,盡管如此,部分單抗的染色結(jié)果不理想。這可能由下列兩個(gè)原因造成:抗原表位被覆蓋在細(xì)胞結(jié)構(gòu)之內(nèi);或者在固定過程中被破壞。
    用單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色時(shí)偶爾也出現(xiàn)交叉反應(yīng)。這種交叉反應(yīng)是特異性的,可能是因?yàn)樵诓煌募?xì)胞組分中存在共同表位。單抗與細(xì)胞內(nèi)高濃度多聚體蛋白,如細(xì)胞骨架蛋白所致的交叉反應(yīng)是常見的。這種交叉反應(yīng)一般較弱,但如果抗原濃度較高且雙價(jià)連接,將使交叉反應(yīng)信號增強(qiáng)。應(yīng)盡可能應(yīng)用一系列針對同一抗原不同表位的單克隆抗體來確定抗原的位置。
 
(三)用混合的單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色
應(yīng)用混合單抗進(jìn)行細(xì)胞染色能夠增強(qiáng)染色信號,只要混合的單抗沒有競爭作用,增強(qiáng)信號強(qiáng)度意味著實(shí)驗(yàn)成功。但應(yīng)注意,在混合抗體前,每一種單抗應(yīng)分別經(jīng)過測試。

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