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如何運(yùn)用單克隆-多克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色
閱讀:1632 發(fā)布時(shí)間:2013-8-5如何運(yùn)用單克隆-多克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色
在細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)中,常用單克隆或多克隆抗體。一般而言,多抗能夠提供較強(qiáng)的信號(hào),而單抗的背景清晰。只要注意其特點(diǎn),2種抗體都可以有效地利用。
(一)用多克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色
良好的多抗血清包含多種針對(duì)抗原不同表位的抗體,雖然空間競(jìng)爭(zhēng)阻止大量抗體與抗原分子結(jié)合,但數(shù)個(gè)抗體分子的結(jié)合往往得到較強(qiáng)的信號(hào)。能夠產(chǎn)生信號(hào)強(qiáng)信號(hào)是用多抗進(jìn)行細(xì)胞染色的主要優(yōu)點(diǎn)。
多抗血清中除了含有特異性抗體外,還含有較高濃度的無關(guān)抗體,這些抗體包括動(dòng)物血清中所有的抗體成分。這些抗體是細(xì)胞染色的zui大。用多克隆抗體可以帶來令人滿意的結(jié)果,但必須仔細(xì)設(shè)立對(duì)照。這包括仔細(xì)滴定一抗,盡量減低無關(guān)抗體產(chǎn)生的信號(hào),仔細(xì)比較對(duì)照血清的染色結(jié)果。
即使血清來自未經(jīng)免疫的動(dòng)物,在高濃度情況下,也能引起較強(qiáng)的背景色。部分原因是由于抗體的非特異性附著在經(jīng)固定后的細(xì)胞上,部分是由于血清中抗體特異性結(jié)合所致。由于這些抗體在血清中并非主要活性成分,因此可以通過稀釋抗體使其信號(hào)降低至不被檢測(cè)出的程度。第二種降低這些背景信號(hào)的方法是用丙酮干燥粉預(yù)先吸收多抗血清。第三種方法是去除血清中的非特異性抗體,利用免疫親和純化的方法可以得到適用于細(xì)胞染色的良好的抗體來源。在某些情況下,利用免疫親和法純化抗體是得到清晰染色結(jié)果的基本步驟之一。
由于多抗血清包含的抗體通常是針對(duì)抗原的多種表位,包括不易變性的表位,因此這些抗血清在用于經(jīng)過*固定的標(biāo)本染色時(shí)效果較好,尤其是用于經(jīng)甲醛固定標(biāo)本的染色。
(二)用單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色
用單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色往往得到良好結(jié)果,因?yàn)閱慰辜兌雀?、特異性?qiáng),在較寬的濃度范圍內(nèi)染色的背景色清晰。對(duì)經(jīng)有機(jī)溶劑或甲醛固定的細(xì)胞,大部分單抗可以得到較好的染色結(jié)果,盡管如此,部分單抗的染色結(jié)果不理想。這可能由下列兩個(gè)原因造成:抗原表位被覆蓋在細(xì)胞結(jié)構(gòu)之內(nèi);或者在固定過程中被破壞。
用單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色時(shí)偶爾也出現(xiàn)交叉反應(yīng)。這種交叉反應(yīng)是特異性的,可能是因?yàn)樵诓煌募?xì)胞組分中存在共同表位。單抗與細(xì)胞內(nèi)高濃度多聚體蛋白,如細(xì)胞骨架蛋白所致的交叉反應(yīng)是常見的。這種交叉反應(yīng)一般較弱,但如果抗原濃度較高且雙價(jià)連接,將使交叉反應(yīng)信號(hào)增強(qiáng)。應(yīng)盡可能應(yīng)用一系列針對(duì)同一抗原不同表位的單克隆抗體來確定抗原的位置。
(三)用混合的單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞染色
應(yīng)用混合單抗進(jìn)行細(xì)胞染色能夠增強(qiáng)染色信號(hào),只要混合的單抗沒有競(jìng)爭(zhēng)作用,增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度意味著實(shí)驗(yàn)成功。但應(yīng)注意,在混合抗體前,每一種單抗應(yīng)分別經(jīng)過測(cè)試。
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