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技術(shù)文章

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中周期的測定

閱讀:1868          發(fā)布時間:2013-7-22

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中周期的測定
一、原理
     細(xì)胞周期指細(xì)胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。
單個細(xì)胞的周期測定可采用縮時攝影的方法,但它不能代表細(xì)胞群體的周期,故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。
測定細(xì)胞周期的方法很多,有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等,這里介紹一種利用BrdU滲入測定細(xì)胞周期的方法。
BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養(yǎng)基后,可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料,經(jīng)過兩個細(xì)胞周期后,細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2,反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期,則染色體中約一半為兩條單體均淺染,另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個周期,則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例,就可算出細(xì)胞周期的值。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器、用品:同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)
2、試劑:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液
三、操作步驟
1、細(xì)胞生長至指數(shù)期時,向培養(yǎng)液中加入BrdU,使zui終濃度為10μg/ml。
2、44小時加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。
3、48小時后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中,注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。
4、常規(guī)染色體制片(見第三部分:染色體技術(shù))。
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,鋪上2×SSC 液,距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
6、棄去2×SSC液,流水沖洗。
7、Giemsa液染色10分鐘,流水沖洗,晾干。
8、鏡檢100個分裂相,計(jì)*、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。
9、計(jì)算: 細(xì)胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小時)
附:(1)BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml   4℃下避光保存。
   (2)2×SSC配制: NaCl 1.75克,檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克,加水至100ml,4℃保存

上海恒遠(yuǎn)產(chǎn)品涵蓋免疫調(diào)節(jié)蛋白、白介素、集落刺激因子、生長因子、化學(xué)趨化因子、干擾素、脂聯(lián)素、成纖維生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、腫瘤壞死因子、神經(jīng)營養(yǎng)素和防御素等諸多生命科學(xué)研究領(lǐng)域中重要的生物活性分子。 為跟蹤當(dāng)今科研發(fā)展、滿足日益增長的需求,上海恒遠(yuǎn)研制出無動物成分的重組蛋白 。這些蛋白是利用專有的無動物成分生產(chǎn)設(shè)施,在嚴(yán)格的無動物成分條件下生產(chǎn)出來,因此痕量的動物源性污染引發(fā)潛在問題的可能性被降至zui低,從而*達(dá)到臨床前研究和細(xì)胞治療用標(biāo)準(zhǔn)。此外,上海恒遠(yuǎn)還開發(fā)出無動物成分的培養(yǎng)基添加物試劑盒 。這些試劑盒經(jīng)改良設(shè)計(jì),其中的無血清組分對多種哺乳動物細(xì)胞的生長有更好的維持能力。

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