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細胞培養(yǎng)技術中周期的測定

閱讀:1867          發(fā)布時間:2013-7-22

細胞培養(yǎng)技術中周期的測定
一、原理
     細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。
單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法,但它不能代表細胞群體的周期,故現多采用其他方法測群體周期。
測定細胞周期的方法很多,有同位素標記法、細胞計數法等,這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。
BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養(yǎng)基后,可做為細胞DNA復制的原料,經過兩個細胞周期后,細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2,反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期,則染色體中約一半為兩條單體均淺染,另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期,則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例,就可算出細胞周期的值。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器、用品:同常規(guī)細胞培養(yǎng)
2、試劑:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液
三、操作步驟
1、細胞生長至指數期時,向培養(yǎng)液中加入BrdU,使zui終濃度為10μg/ml。
2、44小時加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。
3、48小時后常規(guī)消化細胞至離心管中,注意培養(yǎng)上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。
4、常規(guī)染色體制片(見第三部分:染色體技術)。
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,鋪上2×SSC 液,距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
6、棄去2×SSC液,流水沖洗。
7、Giemsa液染色10分鐘,流水沖洗,晾干。
8、鏡檢100個分裂相,計*、二、三、四細胞期分裂指數。
9、計算: 細胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小時)
附:(1)BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml   4℃下避光保存。
   (2)2×SSC配制: NaCl 1.75克,檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克,加水至100ml,4℃保存

上海恒遠產品涵蓋免疫調節(jié)蛋白、白介素、集落刺激因子、生長因子、化學趨化因子、干擾素、脂聯(lián)素、成纖維生長因子、轉化生長因子、腫瘤壞死因子、神經營養(yǎng)素和防御素等諸多生命科學研究領域中重要的生物活性分子。 為跟蹤當今科研發(fā)展、滿足日益增長的需求,上海恒遠研制出無動物成分的重組蛋白 。這些蛋白是利用專有的無動物成分生產設施,在嚴格的無動物成分條件下生產出來,因此痕量的動物源性污染引發(fā)潛在問題的可能性被降至zui低,從而*達到臨床前研究和細胞治療用標準。此外,上海恒遠還開發(fā)出無動物成分的培養(yǎng)基添加物試劑盒 。這些試劑盒經改良設計,其中的無血清組分對多種哺乳動物細胞的生長有更好的維持能力。

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