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戊二醛二步法實(shí)驗(yàn)原理及步驟
閱讀:4202 發(fā)布時(shí)間:2013-7-18戊二醛二步法實(shí)驗(yàn)原理及步驟
產(chǎn)品名稱:戊二醛 規(guī)格:BR,25-28% 包裝:100ML/500ML/4LT/20L CAS: 111-30-8 分子式:C5H8O2 分子量:F.W. 100.12 保存條件: RT 作用:科研
戊二醛二步法
1. 原理
戊二醛為一種雙功能試劑,通過(guò)其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。
2. 標(biāo)記步驟
(1)稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室溫靜置夜。
(2)反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱,用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘,收集棕色流出液。如體積大于5ml,則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中,緩慢攪拌。
(3)將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml,攪拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml,繼續(xù)攪拌3小時(shí)。
(5)加0.2M賴氨酸0.25ml,混勻后,置室溫2小時(shí)。
(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨,置4℃ 1小時(shí)。
(7)3000rpm離心半小時(shí),棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次,zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8)將上述溶液裝入透析袋中,對(duì)0.15M PH7.4的PBS緩沖鹽水透析,去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè)),10,000rpm離心30分鐘去除沉淀,上清液即為酶結(jié)合物,分裝后,冰凍保存。
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