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胰酶消化法培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞的具體操作步驟
閱讀:4535 發(fā)布時(shí)間:2013-7-16胰酶消化法培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞
1.1 試劑和動(dòng)物
胰酶購自Sigma公司;α-actin抗體購自上海恒遠(yuǎn)生化有限公司;PBS液各成分均為市售分析純;新生小牛血清購自HyClone;DMEM 為Gibco產(chǎn)品。雄性Wistar大鼠(2只,體重175±25 g)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.2 胰酶消化法原代培養(yǎng)
Wistar大鼠處死,迅速取出胸主動(dòng)脈,浸泡在含無菌PBS的表面皿中,轉(zhuǎn)移到無菌超凈臺(tái)。在表面皿中漂洗主動(dòng)脈去除殘留的血跡,縱向剪開主動(dòng)脈,把主動(dòng)脈鋪平并使內(nèi)膜朝上,用鑷子來回刮除內(nèi)膜層,剝離血管中膜。將剝離的血管中膜用眼科剪剪碎,碎片大小在1 mm×1 mm左右。裝入含0.25%胰酶的玻璃培養(yǎng)瓶中于37℃條件下消化。當(dāng)在顯微鏡下觀察組織塊表面出現(xiàn)大量細(xì)胞時(shí)應(yīng)立即加入血清終止消化,一般消化的時(shí)間在 3.5 h。終止消化后將玻璃培養(yǎng)瓶置于37℃空氣搖床振搖10 min,繼續(xù)用吹打的方法使組織塊表面的細(xì)胞盡可能脫落。待細(xì)胞從組織塊脫離后,120目細(xì)胞篩過濾,轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)離心,棄上清,用含20%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)基吹打細(xì)胞,zui后接種于25 mL培養(yǎng)瓶,放入CO2孵箱培養(yǎng),48 h后換液。
1.3 傳代培養(yǎng)
細(xì)胞融合后,倒去舊的培養(yǎng)液,加入適量的0.25%胰酶,顯微鏡下觀察,見細(xì)胞收縮后去除消化液,加入適量培養(yǎng)液,吹打細(xì)胞,以1∶2接種于新培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)足培養(yǎng)液,放入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。傳代細(xì)胞從第三代開始可換用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。VSMC 至少可以傳16代以上,并且從第二代開始平滑肌細(xì)胞即可凍存。
1.4 動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鑒定
相差顯微鏡下,細(xì)胞未匯合之前多數(shù)呈梭形,至匯合后,部分區(qū)域細(xì)胞束狀排列,呈典型的“峰和谷”狀態(tài)。將傳代獲得的平滑肌細(xì)胞接種于蓋玻片上,3~4天后至亞匯合狀態(tài),取出細(xì)胞爬片,PBS清洗后用4℃純丙酮固定15~30 min,自然晾干。采用小鼠抗大鼠α-肌動(dòng)蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色鑒定VSMC肌動(dòng)蛋白。根據(jù)S-P免疫組織化學(xué)染色的常規(guī)方法,以平滑肌細(xì)胞胞漿棕黃色為陽性結(jié)果。
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