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聚乙二醇沉淀試驗檢測步驟分析

閱讀:2234          發(fā)布時間:2013-6-3

 聚乙二醇沉淀試驗檢測步驟分析CIC
 
    聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一種無電荷的直鏈大分子多糖,可非特異性地引起蛋白質沉淀。沉淀具有可逆性,被沉淀的蛋白質生物活性亦不受影響。不同濃度的PEG可沉淀分子量不同的蛋白質,在pH值、離子濃度等條件固定時,蛋白質分子量越大,用以沉淀的PEG濃度越小。由于PEG 6000對蛋白質沉淀具有良好的選擇性,所以在IC測定中主要采用PEG 6000。
 
    PEG使IC沉淀的機理可能在于使其自液相中空間排斥而析出,此外,PEG還可抑制CIC解離,促進CIC進一步聚合成更大的凝聚物而被沉淀。在被檢血清中加入低濃度PEG,可將血清中的IC沉淀下來,利用透光率比濁或散射比濁法可測出CIC的存在與含量。本法簡便易行,國內已廣泛應用。
 
(一)試劑
    1.0.1mol/L pH8.4硼酸鹽緩沖液(borate buffer solution,BBS)  硼酸(H3B03)3.40g,硼砂(Na2B407·10H20)4.29g,蒸餾水溶解后,加至1 000mL。用G3或G4玻璃濾器過濾。
    2.PEG-NaF稀釋液  PEG 6 000 40.9g,NaF 10.0g,用BBS溶解后加至1 000mL,用G3或G4玻璃濾器過濾。
    3.熱聚合人IgG  將人IgC(10mg/mL)置63℃水浴加熱15rain,立即置冰浴內,冷卻后過Sepharose4B柱或SephacrylS-300柱,收集*蛋白峰。所獲熱聚合人IgG可用考馬斯亮藍法測定蛋白含量。也可取人IgG(10mg/mL)10mL,攪拌下滴加1.8%戊二醛100uL,24h后加入0.4mol/LpH5.4,Tris-HCl緩沖液100uL終止反應,過Sepharose 4B或Sephacryl S-300柱,用0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液洗脫,收集*蛋白峰。加入牛血清白蛋白至0.5%,分裝后—40℃保存。試驗中可用作陽性對照和制備標準曲線。
 
(二)操作步驟
    1.取待測血清0.15mL,加BBS0.3mL(1:3稀釋)。
    2.按表10—1加入各液(待測血清zui終稀釋倍數(shù)為1:33,PEGzui終濃度為3.64%)。
    3.將測試管及對照管置37℃水浴60rrfin。
    4.分光光度計在波長495nm測吸光度,用對照管調零。
 
(三)結果判斷
    待測血清濁度值:(測定管吸光度—對照管吸光度)X100。以大于正常人濁度值的均值加2個標準差為CIC陽性。
    參考值:4.3±2.0,以大于或等于8.3為CIC陽性。或以不同濃度熱聚合人IgG按以上方法操作制備標準曲線,根據(jù)待測血清吸光度值查標準曲線,即可得IC含量(相當于熱聚合人IgG的ug/mL)。
 
(四)注意事項
    1.低密度脂蛋白可引起濁度增加,故應空腹采血。
    2.高丙球血癥或血脂含量過高及標本反復凍融,均可導致IC檢測出現(xiàn)假陽性。
    3.此法快速、簡便,但特異性較差,較適用于血清標本的篩查。

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