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蛋白質(zhì)的免疫染色法檢測(cè)分析
閱讀:2505 發(fā)布時(shí)間:2013-4-17蛋白質(zhì)的免疫染色法檢測(cè)分析
轉(zhuǎn)印到紙上的蛋白質(zhì)抗原,可與其專一性抗體結(jié)合,再以二次抗體-酶結(jié)合體(2nd Ab-HRP) 或Protein A-HRP 呈色;可在一群轉(zhuǎn)印色帶中,專一性地挑出目標(biāo)蛋白質(zhì),是zui有用的檢定工具 (Burnett,1981)。
藥品試劑:
抗體溶液:可用傳統(tǒng)抗血清或單株抗體,其zui適使用濃度,隨抗體效價(jià)不同而異,以下為一般適用范圍的參考,均以明膠-NET 稀釋的。
a. 傳統(tǒng)抗血清: 1:100 到1:1,000
b. IgG (冷凍干燥品): 10~50 μg/mL
c. 單株抗體 (小白鼠腹水) : 1:200到1:5,000
d. 單株抗體 (細(xì)胞培養(yǎng)液): 原液或1:10明膠-NET:用來稀釋抗體溶液或酶聯(lián)體明膠gelatin (Merck 4070, 0.25%) 5.0 gm;NaCl (0.15 M) 17.5 gm;EDTA (5 mM) 3.6 gm;Tween-20 (0.05%) 1.0 mL;Tris (Tris base, 50 mM) 12.1 gm加熱溶解于1,800 mL 純水后pH 調(diào)到8.0,再加水到 2,000 mL
酶聯(lián)體:
可使用2nd Ab-HRP 或Protein A-HRP,使用濃度每家商品不同,約為1:1,000到1:5,000 的間,以明膠-NET 稀釋的。
PBST 洗液
DAB 基質(zhì)溶液:DAB (diaminobenzidine, Sigma D-5637) 5 mg溶于100 mL Buffer A-0,再加10 μL H2O2,新鮮配制,避光貯存。 DAB 為致癌物質(zhì),稱量時(shí)勿吸入DAB 細(xì)塵,并小心處理秤量紙。
方法步驟:
1) 尿素洗過夜的轉(zhuǎn)印紙?jiān)僖?0 mL PBST 洗三次,每次約10 min,均在上述方形培養(yǎng)皿中進(jìn)行。
2) 轉(zhuǎn)印紙放在明膠NET 溶液中反應(yīng),置室溫中反應(yīng)1 h。一般使用方形培養(yǎng)皿當(dāng)容器,但亦可裝入塑料袋中反應(yīng),較節(jié)省試劑用量。
3) 反應(yīng)后,以PBST 浸洗二次。
4) 把轉(zhuǎn)印紙放在抗體溶液中反應(yīng),置室溫反應(yīng)1 h。
5) 反應(yīng)后以PBST 洗三次,改用酶聯(lián)體反應(yīng),在室溫下反應(yīng)1 h。
6) 以PBST 洗四至五次,注意容器也要洗干凈。
7) 加入DAB 基質(zhì)溶液約10 mL 呈色,盡量避光,并且不時(shí)搖動(dòng)呈色液。
8) 數(shù)分鐘內(nèi)可呈色,在背景加深前倒去DAB,以水沖過數(shù)次后晾干。
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