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技術(shù)文章

ELISA測(cè)定血漿中C

閱讀:2456          發(fā)布時(shí)間:2013-4-15

血漿中C的ELISA測(cè)定
 實(shí)驗(yàn)原理
將抗C單克隆抗體包被固相聚苯乙烯板,加入經(jīng)聚乙二醇(PEG)處理的待測(cè)樣本,然后依次加入兔抗人C-IgC多克隆抗體和過氧化物酶標(biāo)記的豬抗兔IsC,再加入底物2,2’-連氮-雙(3-乙基苯駢唑啉-6-磺酸鹽)(ABTS)和H2O2顯色,于酶標(biāo)儀405mn處測(cè)定每分鐘光密度增加量(OD/min),以O(shè)D/min為縱坐標(biāo),C標(biāo)準(zhǔn)晶濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,求出待測(cè)樣本中C的含量。


實(shí)驗(yàn)試劑
1. PBSPH7.2,9mmol/L磷酸鹽緩沖液含140mmol/L NaCl。

2. PBS-Tween pH7.2 PBS含0.05%Tween20,簡(jiǎn)稱PBS-T。

3. 底物溶液:100mL 2mmol/L ABTS溶液中含100mmol/L醋酸鈉,50mmol/L磷酸鈉,2.5mmol/L H2O2。

4. 沉淀劑:①:100mL pH8.0,20mmoL/L Tris-甘氨酸-HCl緩沖液中含20g PEG 4 000,0.8g Rivanol;沉淀劑②:100mLpH2.0.100mmol/L甘氨酸-HCl緩沖液中含20g PEG4000。


實(shí)驗(yàn)步驟
1. 用鹽和/或PEG沉淀血漿中C5:在微量反應(yīng)板中加入EDTA抗凝血漿100gL,然后加人100/uL沉淀劑,用下述三種方法中任何一種沉淀血漿中C5。

1) 在微量反應(yīng)板中加入100uL 2mol/L HCl與100uL EDTA抗凝血漿混合,室溫5h。加入HCl后血漿pH值在1.0-1.5之間。上清用4倍體積的0.29mol/L Tris調(diào)節(jié)至pH7.1-7.4。

2) 在微量反應(yīng)板中加入100uL沉淀劑①,室溫30min。

3) 在微量反應(yīng)板中加入100uL沉淀劑②(血漿pH值在4.0-4.5之間)。室溫30min。用方法2)和方法3)沉淀C5后,上清加入4倍體積的含0.05%Tween 20 pH7,10.21mol/L Tris-HCl緩沖液,血漿被稀釋10倍。

2. 用抗C單克隆抗體(McAb)包被酶標(biāo)反應(yīng)板:用pHl0.6,50mmol/L碳酸鈉溶液將抗CMcAb稀釋成10ug/mL,每孔加100uL,4℃ 16h。次日取出每孔加含1%(W/V)明膠的PBSl50gL,室溫lmin;然后用PBS-Tween 20洗滌一次。

3. 樣本中CSa的檢測(cè):

洗滌后的酶標(biāo)板,每孔加入方法1)、2)或3)處理的血漿樣本zoot&,4℃16h,用PBS-Tween20洗滌1次,每孔加入用含0.1%明膠的PBS-T稀釋的兔抗人CSa-IgC.多克隆抗體(46ug/mL)100t&,室溫2h,用PBS-Tween20洗滌3次;每孔加入用含0.1%明膠PBS-T稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的豬抗兔IgClOOt&(稀釋前l(fā)mL過氧化物酶偶聯(lián)物內(nèi)加100ul無關(guān)鼠McAb、10ul人血漿或10ul激活的人血清處理),室溫2min,每孔用PBS-Tween20洗滌4次;每孔加入底物溶液100ul,lmin后以PBS-T調(diào)零,每3min于酶標(biāo)儀405nm處讀取OD值。以O(shè)D/min增加量計(jì)算過氧化物酶活性。其活性與血漿中C含量呈正相關(guān)。本法zui低檢測(cè)極限為1ng/mL,此法未檢測(cè)出正常人新鮮血漿中的C。

4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取已知濃度純化的C,對(duì)倍稀釋成一系列不同的濃度(0.039-5.000ng/mL),分別加入包被有抗CMcAb的酶標(biāo)板中,然后按上述方法依次加入兔抗人C-IgC和過氧化物酶偶聯(lián)的豬抗兔IgC及過氧化物酶的底物,以PBS-Tween調(diào)零點(diǎn),讀取OD40s/min增加量,以C(desarg)濃度為橫坐標(biāo),OD40s/minx 200為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)取6個(gè)已知濃度的純化C。


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