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免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。

該技術(shù)的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。

主要缺點是：非特異性染色問題尚未完quan解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。

一、原理

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。

間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于雞任何抗原的診斷。

二、技術(shù)分類：

1.熒光抗體技術(shù)（熒光顯微鏡技術(shù)）

抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。

2.免疫熒光測定技術(shù)：

抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法。

1）熒光物質(zhì)

熒光色素

許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。

常用的熒光色素：

（1）異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，zui大吸收光波長為490495nm，zui大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都geng好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用zui廣泛的熒光素。

其主要優(yōu)點是：

①人眼對黃綠色較為敏感

②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。

（2）四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙-酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。zui大吸收光波長為570nm，zui大發(fā)射光波長為595-600nm，呈橘紅色熒光。

（3）四甲基異硫氰酸羅丹明，zui大吸引光波長為550nm，zui大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。

常見熒光素的特性：

1）FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490～495nm，發(fā)射光：520～530nm，明亮的黃綠色熒光。

2）RB200： 橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光 595～600nm，橘紅色熒光。

3）TRITC： 紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光 620nm，橙紅色熒光。

4）鑭系：Eu3+、Tb3+

5）PE：吸收光490～560nm，發(fā)射光 595nm，紅色熒光。

6）其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。