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技術(shù)文章

大腸埃希菌感染的診斷與防治

點擊次數(shù)：1852 發(fā)布時間：2013-6-8

 大腸埃希菌感染的診斷與防治

 

 

   2011年5月起，德國出現(xiàn)新型腸出血性大腸埃希菌（enterohhaemorrhagic Escherichia coli, EHEC）感染的疫情，來勢兇猛，很快蔓延到英國、荷蘭、法國、奧地利、挪威、西班牙、瑞士、丹麥、芬蘭、捷克等幾乎整個歐洲國家，美國也發(fā)現(xiàn)了確診病例。截止6月底，已報告有3600余人發(fā)病，死亡52人。更為嚴(yán)重的是，有852例感染者（約20%）發(fā)生了溶血性尿毒綜合征（haemolytic uremic syndrome, HUS）?；颊咴诟篂a、發(fā)熱后很快出現(xiàn)急進(jìn)性的腎功能衰竭、血小板減少和血管內(nèi)溶血等癥狀而危及生命[2]。因此，及時的診斷和進(jìn)行搶救性治療成為關(guān)鍵。

1 新型病原菌的確定
已知的致病性大腸埃希菌有產(chǎn)毒素性、致病性、侵襲性、腸出血性和腸聚集黏附性5種。我國學(xué)者[3]報告的產(chǎn)志賀毒素且具侵襲力者尚需更多研究證實。EHEC有200余種血清型，通常流行的是O157∶H7血清型，此血清型引起的爆發(fā)性流行在世界許多國家和地區(qū)，包括我國的安徽省等地均發(fā)生過。這次歐洲大范圍流行的病原體經(jīng)過有我國科學(xué)家參與的全基因組測序發(fā)現(xiàn)它是O104∶H4血清型，其基因有80%來自O104型細(xì)菌，另20%來自腸聚集黏附性大腸埃希菌（enteroaggregative Escherichia coli, EAggEC）。代表菌株TY2482與2002年自中非的艾滋病患者的腹瀉標(biāo)本中分離的EAggEC（代表菌株55989）有超過93%的同源性。EAggEC常引起兒童和成人的急性或持續(xù)性腹瀉。目前所形成的基因雜交變種缺失了EHEC毒力島上的eae基因和pO157大質(zhì)粒上的ehxA基因，卻獲得了EAggEC的數(shù)種毒力基因，包括aggA至aggD的4個基因等?？梢哉J(rèn)為，它結(jié)合了EHEC和EAggEC的基因特性[5]。人們對此新型菌株缺少免疫力，故形成產(chǎn)志賀毒素腸聚集性大腸埃希菌（shiga toxin-producing enteroaggregative Escherichia coli, STEAEC）的爆發(fā)流行，震驚了世界。

2 新型病原菌的致病機(jī)制
2.1 新型病原菌的致病機(jī)制主要是能在患者體內(nèi)產(chǎn)生志賀毒素。志賀毒素以前也被稱為Vero細(xì)胞毒素，類志賀毒素，故EHEC與Vero細(xì)胞毒素大腸埃希菌和志賀毒素大腸埃希菌實為同義詞。志賀毒素作用于腸道引起腹瀉，其病理表現(xiàn)為腸黏膜出血和水腫，伴有和致病性大腸埃希菌引起的與緊密黏附/擦傷（A／E）相似的細(xì)胞損傷，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+和IP3升高，進(jìn)一步加劇損傷。編碼志賀毒素的基因主要有stx1和stx2，還有一些變異體。志賀毒素與痢疾菌的毒素性質(zhì)相近，由A、B兩個亞單位組成。相對分子質(zhì)量為32×103的A亞單位為蛋白溶解性，B亞單位為五聚體，與腸道細(xì)胞上的糖脂性受體結(jié)合而起作用。志賀毒素是引起腸出血和HUS的重要因子，stx2在導(dǎo)致HUS中比stx1更為重要，且對腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞有更大毒性，其編碼基因分為stxA2和stxB2。已證明，此次新型菌株流行易造成腎臟急性損傷，與其可產(chǎn)生更多的stx2有很大關(guān)系[6]。
2.2 來自EAggEC的聚集黏附菌毛I型基因簇（AAF/I） AAF/I是感染菌黏附于腸壁的重要因子，同時在腸壁發(fā)生緊密黏附/擦傷（A／E）樣的細(xì)胞損傷。據(jù)Qin等[7]研究，上述兩基因（簇）是新型流行菌株的重要特征。經(jīng)對54株歐洲流行菌的檢驗，有52株同時檢出stx2和AAF/I兩種基因，認(rèn)為可以常規(guī)應(yīng)用于對該菌的檢驗和鑒定。
2.3 其他毒力因子 如質(zhì)粒編碼的腸溶血素，EHEC通常具有相對分子質(zhì)量為60 000×103的質(zhì)粒，編碼溶血素。原在德國發(fā)生的感染，90％的產(chǎn)志賀毒素菌株有此質(zhì)粒，質(zhì)粒的基因為ehxA，ehxB，ehxC，ehxD。溶血素可溶解紅細(xì)胞以供應(yīng)EHEC更多的鐵并促其生長。ChuA基因即大腸桿菌含鐵血紅蛋白利用基因編碼相對分子質(zhì)量為69×103的外膜蛋白，可使EHEC利用溶血的鐵促進(jìn)生長。細(xì)菌的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是菌體O抗原結(jié)構(gòu)的組成部分，可增強(qiáng)志賀毒素的細(xì)胞毒性。


3 臨床表現(xiàn)
EHEC可導(dǎo)致急性出血性腹瀉、出血性結(jié)腸炎和HUS。可出現(xiàn)的并發(fā)癥有膽囊炎、腸穿孔、胰腺炎、闌尾炎、肺炎、出血性膀胱炎、肺水腫、心肌損傷和神經(jīng)癥狀，zui嚴(yán)重的是發(fā)生HUS。過去流行中的EHEC感染者只有不足10％發(fā)生HUS（多發(fā)生在16歲以下兒童或老年人），其潛伏期3-4 d，也可短至1-2 d?；颊叱霈F(xiàn)腸絞痛、低熱、血便，約半數(shù)有嘔吐。發(fā)生HUS的患者表現(xiàn)為微血管異常溶血性貧血、血尿、少尿或無尿、皮下黏膜出血、血小板減少和急進(jìn)性腎功能減退，可迅速出現(xiàn)腎功能衰竭，常危及生命。尤其值得注意的是，抗生素的應(yīng)用可使菌體裂解釋放出更多志賀毒素，易引起HUS以及菌群失調(diào)，給治療帶來困難，應(yīng)特別注意。

4 檢驗診斷
4.1 糞便常規(guī)檢驗 糞便常規(guī)檢驗有肉眼可見的鮮血或顯微鏡下的紅細(xì)胞，這是提示該菌感染的重要線索。鏡下白細(xì)胞也較多。
4.2 糞便培養(yǎng) ①細(xì)菌的分離培養(yǎng)應(yīng)盡早進(jìn)行，在發(fā)病2 d內(nèi)分離率可達(dá)100％，3-6 d則由91.7％降至30.3％。常規(guī)應(yīng)用的麥康凱和中國藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基適用，而SS瓊脂培養(yǎng)基因可抑制部分大腸桿菌生長而不適用。美國疾病預(yù)防控制中心建議對血便應(yīng)用山梨醇麥康凱瓊脂（sorbitol macconkey agar, SMAC）選擇性培養(yǎng)基。EHEC不發(fā)酵山梨醇，在此培養(yǎng)基上生長為白色的菌落為可疑，再進(jìn)一步鑒定其O、H抗原。②增菌培養(yǎng)。糞便接種于含50 ng/mL頭孢克肟和40 μg/mL萬古霉素的 GN肉湯或胰酶大豆湯內(nèi)，經(jīng)4 h增菌后分離可提高檢出率。③改良SMAC選擇性培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中加入亞銻酸鹽或加入新生霉素以選擇性地抑制其他大腸桿菌生長。由于EHEC也不發(fā)酵鼠李糖，故含有頭孢克肟、山梨醇和鼠李糖的培養(yǎng)基有更佳的選擇性。
4.3 生化反應(yīng)初步鑒定EHEC一般不發(fā)酵山梨醇和鼠李糖，其β葡萄糖醛酸酶也為陰性?？捎?beta;葡萄糖醛酸酯的發(fā)色或熒光底物來檢測，是快速鑒定EHEC的一種手段。在非選擇性的腸溶血素瓊脂培養(yǎng)基溫育3 h和過夜出現(xiàn)溶血的菌落也有提示作用。但應(yīng)注意這些生化指標(biāo)對檢驗STEAEC的結(jié)果尚無報告。發(fā)酵山梨醇和β葡萄糖醛酸酶陽性的EHEC菌株均曾出現(xiàn)過。
4.4 確定細(xì)菌的O、H抗原 這是確定菌型的關(guān)鍵。傳統(tǒng)方法應(yīng)用大腸埃希菌的O、H分型血清與菌落進(jìn)行凝集試驗，但H抗原的檢出常需進(jìn)行誘導(dǎo)?，F(xiàn)有用O和H抗原的單克隆抗體致敏的膠乳凝集法。已報告有商品ELISA試劑盒直接自糞便中檢測O抗原的快速方法。
4.5 志賀毒素檢查 志賀毒素的檢驗方法有ELISA法，反向膠乳凝集法（VTEC-RPLA，OXOID公司，日本SEIKEN公司）、檢測LPS的ELISA法和免疫磁珠分離菌體再測毒素的方法等。經(jīng)典的方法是用Vero細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒試驗，觀察在毒素作用下細(xì)胞的特異性形態(tài)改變。
4.6 基因診斷 如上述，推薦用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測stx2和AAF/I兩種基因，均為陽性即可確定為STEAEC?？捎枚嘀?/span>PCR同時檢查多種基因。Paton等同時檢查stx1、stx2、eae、ehxA、saa 5種基因?qū)?/span>EHEC的鑒定取得滿意結(jié)果。新興起的基因芯片在菌種鑒別及流行菌株的確定和研究中起著重要作用，但目前尚不適宜常規(guī)應(yīng)用。
4.7 流行菌株的確定 由于EHEC常發(fā)生爆發(fā)流行，所以流行病學(xué)調(diào)查，追蹤感染源和確定流行菌株有著關(guān)鍵性意義。常需要用PCR-基因限制性片段多態(tài)性分析，PCR-隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析，PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，多位點序列分型技術(shù)和質(zhì)粒DNA酶切指紋圖譜等分子生物學(xué)技術(shù)來確定流行菌株的同源性。
4.8 血清學(xué)診斷 過去在診斷O157∶H7 EHEC的感染中用患者感染期和恢復(fù)期血清與流行菌株的菌液做凝集試驗，有4倍以上凝集滴度升高者，可確診。此法只能作為回顧性診斷和流行病學(xué)調(diào)查。在此次STEAEC的流行中的診斷作用尚未見報告。
4.9 抗菌藥物敏感性試驗 據(jù)現(xiàn)有資料，本菌對氨芐西林、多種頭孢類、四環(huán)素類耐藥，對氨基糖苷類、環(huán)丙沙星、碳青霉烯類、磷霉素敏感。


5 EHEC感染的防治
對感染患者的治療中一個很重要的問題是不能隨意使用抗生素。因為在抗生素作用下，菌體大量裂解，可增加菌體內(nèi)志賀毒素的釋放，使病情加重，以致促進(jìn)HUS的發(fā)生。因此輸液、補(bǔ)充電解質(zhì)和調(diào)節(jié)腸道的細(xì)菌群是治療的重要手段。如疑似發(fā)生了HUS，應(yīng)該及時輸入新鮮血漿、濃縮紅細(xì)胞和血小板。搶救重癥患者需采用血液透析療法，使用肝素、蛋白酶抑制劑療法。密切監(jiān)測腎功能的改變，嚴(yán)重者要及時做腎切除或腎移植手術(shù)。德國報告研制成功一種對抗志賀毒素的單克隆抗體，在治療危重患者中證明有效。
我國目前尚沒有該病原菌感染報道，提高對該病的認(rèn)識，加強(qiáng)預(yù)防十分重要。該菌存在于家畜（牛、雞、羊、狗、豬等）的腸道。家畜糞便污染的食物是主要的感染源。蔬菜、水果是受污染的主要食品。多數(shù)患者是因生食了黃瓜、西紅柿或生菜、沙拉等而被感染。在歐洲流行的初期，德國曾發(fā)布信息，認(rèn)為流行菌株來源于從西班牙進(jìn)口的黃瓜，但未有直接證據(jù)。后經(jīng)檢驗證明德國產(chǎn)的豆芽等芽苗菜，是此次疫情的源頭。被細(xì)菌污染的水源（包括飲用水、游泳池水、湖水、地表水等）也是重要的傳播媒介。人與人間的密切接觸也可傳染，因未治愈的患者糞便和受污染的環(huán)境中也可帶菌。要防止“病從口入”，要避免生食蔬菜和水果，或者在食用前認(rèn)真洗滌和消毒。不要飲生水，注意飯前、便后的認(rèn)真洗手。有關(guān)部門要切實加強(qiáng)食品衛(wèi)生監(jiān)督，搞好水源管理，加強(qiáng)對家畜、家禽、奶類和肉類產(chǎn)品的管理，避免經(jīng)食品和水源而傳播EHEC。我國衛(wèi)生部已及時發(fā)出感染防控通知和初步的檢驗流程要求，應(yīng)切實執(zhí)行。

 

 

 

 

廣州健侖生物科技有限公司

徐華

2012/10/20

 

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