徠卡顯微鏡的電子光學系統(tǒng)

 

徠卡生物顯微鏡相當于掃描電子顯微鏡的電子光學系統(tǒng)‘所不同之處是：L出射的電子束束流強度要大，而且要穩(wěn)定。電子束直徑一般為iP、不能因縮小電子轟擊區(qū)而過分縮小電子束直徑，因為束流強度與京的半徑8／3次方成正比。2．發(fā)射電子之間能量的離散要小。因此往往采用熱電子發(fā)射的三極電子槍。3物鏡的中心不能太小。因為X射線以大角度射出，為了提高譜儀效率也必須大角度收集。因此物鏡線圈所占空間要大為縮小。辦法之一是用小線圈透鏡，通強電流。但電流強產(chǎn)熱多，就必須用冷阱冷卻物鏡。

 

徠卡生物顯微鏡生物醫(yī)學標本常用冰凍超薄切片。由于x射線收集時間長達幾十秒甚至100秒。束流強度很大的電子束在這樣長的時間內轟擊標本會把標本燒毀，因此必須注入液氮，使標本溫度在一800c以下。諾儀可對待征x射線進行波長及能量分析。進行波長分析時的被語儀主要是合適的分光晶體，在一定角度使x射線產(chǎn)生衍射。目前多用的是對特征x射線進行能量分析的能譜儀。電鏡室常用的是51（u）x射線能諾儀。它的探測器是si（H）二極管理漂移硅型）。這種半導體探測器可以看作一種“固體電離室”。當x射線進入探測器后，在半導體的靈敏區(qū)內損耗能量產(chǎn)生電子一空穴時，將它們收集后可形成電脈沖記錄下來*由于si（Li）半導體的靈敏區(qū)大，所以探測效率高。又由于產(chǎn)生一個電子一空穴時所需的平均能量很低，所以這種探測器靈敏度和統(tǒng)計特性都比較好。s1（Li）能譜儀的分析速度快，可以同時分析和確定樣品中含有的原子序數(shù)z＞11的所有元素。雖然該類能諾儀的缺點是能量分析率低，約150ev（波譜儀約5ev），但由于快速分析及效率高等突出優(yōu)點，目前已成為掃描電鏡和透射電鏡上的主要附件。能譜儀都與計算機連用。熒光屏上不但顯示特征x射線譜，而且計算機技能量分布依次給出元素名稱及濃度。

 

徠卡顯微鏡的標本制備方法

 

徠卡生物顯微鏡70年代在探針技術上有兩大進展，*是將透射電鏡與x微區(qū)分析結合*第二是固態(tài)能量色散x一線探測器的應用。這便使得操作人員可將一細電子束準確地置于某細胞器內，使探針電流控制在幾個nA范圍內，減少了對標本的損傷，提高了像的質量。為此，對標本的制備提出了更高的要求。幾個實驗室不約而同地在探索如何在保存超微結構的同時也保存元素成分在原位而不移動或丟失。HaH實驗室的工作人員研究肌細胞線粒體對鋇的攝取，他們發(fā)現(xiàn)用醋酸鈾染色后線粒體中只有鈾而無鋇，只有在不經(jīng)染色的標本中線粒體內才有鋇。他們在研究雞胚紅細胞核中的鈉和其它電解質時，發(fā)現(xiàn)胞核內鈉濃度幾乎與胞外介質無差別。但他們對標本進行冰凍切片和冰凍干燥處理后，發(fā)現(xiàn)上述結果是錯誤的。因此Hall等認為標本制備的*方法是將組織立即冰凍（即粹冷固定）．然后用徠卡冰凍切片機做冰陳超薄切片?；驅Ρ鶅龀∏衅苯佑^察分析，或將其冰凍干燥后再觀察。他特別提出在分析組織的細胞外空間成分時，用未經(jīng)干燥的冰凍超薄切片直接分析。

 

徠卡生物顯微鏡由于組織未經(jīng)四氧化鑰固定和染色，在經(jīng)過冰涼固定后結構雖得以保存．但反差相當差。人們又想到是否可用低溫置換固定或組織經(jīng)冰凍干燥后再包埋、切片及染色以提高反差，增進像的質量。R加s實驗室在此方面做了較深入的工作。他們以大鼠胰腺外分泌細胞不同部位的電解質分布為觀測對象，比較幾種標本處理方法的優(yōu)劣。首先對大鼠做主動脈灌注，然后對胰腺作原位冰凍固定．或移出后做冰凍固定。他們對冰凍固定后的胰腺用自制的裝置做以下幾種處理；1．作多聚甲醛和四氧化俄低溫置換固定及樹脂包埋（Fs）；2．低溫干燥后進行樹脂包埋（四）和L冰凍超薄切片后進行冰涼干燥（cs）。然后分別對細胞的頂部胞漿、基部腦漿、酶元顆粒及錢糧體中的Ha、M8、P、s、酗、K及Ca做定量測定（刪1／k8drywt）。其結果如表lo一1所示。由表可見，幾種方法的結果十分不同。低溫置換固定后包埋使電解質丟失zui多。即使低溫干燥后做樹脂包埋也有明顯丟失，特別在頂部及基部胞漿中磷和鉀丟失zui多。RoM等認為是由于使用了高度疏水的sPun和Epn樹脂包埋時，使磷脂提取，質膜損傷后胞內可移動的鉀及其它成分漏出所致。因此，RM的結論是對于研究元素在細胞內不同部位及細胞器中的分布而言，組織冰凍固定、冰凍超薄切片及隨后的冰凍干燥是的方法。

 

備注:徠卡顯微鏡儀器結構特點部分文章由北京中儀光科科技發(fā)展有限公司編輯上傳。