YIJI動(dòng)物細(xì)胞高純高爾基體分離試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

YIJI動(dòng)物細(xì)胞高純高爾基體分離試劑是一種旨在通過(guò)機(jī)械或化學(xué)處理、差速和等密度離心方法，從動(dòng)物細(xì)胞中分離出活性完整而高度純化的高爾基細(xì)胞器組分的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其制備物產(chǎn)量高，活性保證，純度可達(dá)99％。適合于各種動(dòng)物細(xì)胞，包括人體細(xì)胞等的高爾基體的制備?？梢员挥糜谑荏w循環(huán)、糖蛋白和脂蛋白合成，以及抗體釋放機(jī)制等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量高。

技術(shù)背景

高爾基體（Golgi apparatus或Golgi bodies），又稱為高爾基復(fù)合體（Golgi complex），是一種細(xì)胞器，存在于大多數(shù)真核生物細(xì)胞中。高爾基體由扁平膜結(jié)合的高爾基堆（stacks），即小池（cisternae）組成，約有4至8層，分成3個(gè)功能區(qū)：順面、中層、反面等，進(jìn)一步地構(gòu)成細(xì)胞膜、分泌泡、內(nèi)涵體等。高爾基體整合各種大分子進(jìn)行加工、分類和包裝，然后分門(mén)別類地送到細(xì)胞特定的部位或分泌到細(xì)胞外。高爾基體參與糖蛋白質(zhì)的糖基化、碳水化合物的合成、蛋白質(zhì)的分泌、膜轉(zhuǎn)化、溶酶體形成的細(xì)胞活動(dòng)。高爾基體的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的常用手段之一：*，通過(guò)機(jī)械或化學(xué)方法破裂組織細(xì)胞；第二，通過(guò)低速差速離心去除殘?jiān)樾己途薮蠹?xì)胞器；第三，通過(guò)高速差速離心獲得高爾基體；甚至，第四，可以通過(guò)等密度離心獲得純度更高的高爾基體。 

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI凈化液（Reagent C）   毫升

YIJI活性液（Reagent D）   微升

YIJI強(qiáng)化液（Reagent E）   毫升

YIJI保存液（Reagent F）   毫升

YIJI高純液（Reagent G）   毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)   1份

保存方式

保存YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（YJ12028）或PBS緩沖溶液（YJ12033）：用于清理細(xì)胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（YJ12024）：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液（YJ12052）：用于中和胰蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

6毫升超速離心管：用于超高速離心的容器

4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

4℃超速離心機(jī)：用于樣品制備

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

試管固定支架：用于離心管固定支撐

3號(hào)針筒和18號(hào)針頭：用于收集樣品

實(shí)驗(yàn)步驟

• 組織勻漿法

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）凍融，然后移出移取xx微升YIJI活性液（Reagent D）、 xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）到xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為YIJI裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 107），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個(gè)15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的xx毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿幫勻化細(xì)胞（約20至40下）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)7）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• （選擇步驟）小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為10000g
• 小心移出上清液到預(yù)冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrial fraction；PMF）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得微粒體組分
• 即刻加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• 加入xx毫升YIJI高純液（Reagent G），混勻
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心2小時(shí)30分鐘，速度為365000g
• 小心取出超速離心管：可見(jiàn)頂端和中端處（高爾基體樣品帶）和底端處（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶） 
• 小心收集頂端和中端處高爾基體樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號(hào)針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純高爾基體樣品
• 加入xx至xx毫升YIJI保存液（Reagent F）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），混勻
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存
• 化學(xué)處理法

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）凍融，然后移出移取xx微升YIJI活性液（Reagent D）、xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）到xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為YIJI裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 107），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個(gè)15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液管
• 加入預(yù)冷的xx毫升YIJI裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預(yù)冷的xx微升YIJI強(qiáng)化液（Reagent E）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)8）
• 加入預(yù)冷的xx毫升YIJI裂解液（Reagent B），輕輕搖動(dòng)試管混勻
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• （選擇步驟）小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為10000g
• 小心移出上清液到預(yù)冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrial fraction；PMF）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心60分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得微粒體組分
• 即刻加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
• 加入xx毫升YIJI高純液（Reagent G），混勻
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心2小時(shí)30分鐘，速度為365000g
• 小心取出超速離心管：可見(jiàn)頂端和中端處（高爾基體樣品帶）和底端處（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶） 
• 小心收集頂端和中端處高爾基體樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號(hào)針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純高爾基體樣品
• 加入xx至xx毫升YIJI保存液（Reagent F）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為100000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升YIJI保存液（Reagent F），混勻
• 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為10次（5 X 107細(xì)胞）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 操作時(shí)，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent F）
• 所有操作均須在4℃或以下?tīng)顟B(tài)進(jìn)行
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
• 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細(xì)胞顆粒塊消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)
• 對(duì)于難以裂解的細(xì)胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
• 通常5 X 107細(xì)胞的高爾基體含量為15微克蛋白

11． 本產(chǎn)品所獲得的高爾基體純度達(dá)95%以上

12． 高爾基體的標(biāo)志蛋白是UDP半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-galactosyl transferase）；建議使用YIJI純化高爾基體UDP半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒－YJ50414.3

• 本公司提供系列亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的高爾基體維持正?；钚?/span>
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶