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淺析倒置熒光顯微鏡在活體細(xì)胞成像中的應(yīng)用
閱讀：750 發(fā)布時(shí)間：2019-9-5
在活體細(xì)胞成像應(yīng)用中，寬場(chǎng)倒置熒光顯微鏡有助于觀察放置于顯微鏡載物臺(tái)上特定的環(huán)境室中生長(zhǎng)的粘附細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)特性。在基本的配置中，配備有EPI熒光照明的標(biāo)準(zhǔn)倒置組織培養(yǎng)顯微鏡與區(qū)域陣列檢測(cè)器系統(tǒng)（通常是CCD攝像機(jī)）、合適的熒光濾色片和光閘系統(tǒng)耦合，以限制細(xì)胞過(guò)度暴露于有害的激發(fā)光?；镜怪脽晒怙@微鏡依靠精心匹配的干涉濾色片來(lái)選擇特定的帶寬用于照明和檢測(cè)發(fā)射光。光源包括汞、氙氣和金屬鹵化物弧光燈、光束擴(kuò)展激光系統(tǒng)和發(fā)光二極管（LED），所有這些都需要不同的濾色片規(guī)格。用于倒置熒光顯微鏡的合成熒光團(tuán)具有覆蓋近紫外、可見(jiàn)和近紅外區(qū)域的發(fā)射光譜?；蚓幋a熒光蛋白的應(yīng)用極大地?cái)U(kuò)展了倒置熒光顯微鏡在活細(xì)胞成像中的能力，使研究人員能夠地瞄準(zhǔn)感興趣的亞細(xì)胞區(qū)域。
在寬場(chǎng)熒光中，倒置熒光顯微鏡物鏡收集的全孔徑發(fā)射光可以使記錄的信號(hào)大化，同時(shí)使所需的曝光時(shí)間小化。因此，樣本可以用非常短的光照周期成像。寬場(chǎng)成像的主要缺點(diǎn)是，從遠(yuǎn)離焦平面的區(qū)域產(chǎn)生的熒光以及背景信號(hào)都是沒(méi)用的光，這些光通常會(huì)使感興趣的特征模糊。因此，當(dāng)感興趣的特征很大（如細(xì)胞器）或本質(zhì)上具有高度點(diǎn)狀時(shí)，寬場(chǎng)成像可獲得*結(jié)果。各種各樣的活細(xì)胞樣本，包括粘附細(xì)胞、細(xì)菌、酵母和非常薄的組織切片，是寬場(chǎng)熒光成像的理想候選，然而，較厚的組織（超過(guò)5微米）使用更*的方法成像。
盡管合成熒光染料、量子點(diǎn)和熒光蛋白在熒光成像方面有許多進(jìn)展，但在某些情況下，將熒光與其他成像方式結(jié)合起來(lái)是很有幫助的。舉個(gè)例子，DIC可與寬場(chǎng)熒光結(jié)合使用，以監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力和一般形態(tài)，同時(shí)研究特定標(biāo)記目標(biāo)的感興趣的現(xiàn)象。在單張圖像中采集DIC和熒光通常是不切實(shí)際的，但在合適配置的顯微鏡中，這兩種技術(shù)可以依次使用。因此，在落射熒光模式下成像后，可以使用透射光，從熒光標(biāo)記的樣本中采集DIC圖像。這兩個(gè)圖像可以在后期分析過(guò)程中合并。*的寬場(chǎng)顯微鏡配置中可以使用光譜分離照明（如可見(jiàn)光和近紅外）和雙攝像頭或分視圖攝像頭適配器同時(shí)采集DIC和熒光圖像。在大多數(shù)激光掃描共聚焦顯微鏡中，可以同時(shí)以熒光和DIC模式獲取圖像，從而消除了對(duì)采集后處理的需要。也可以與寬場(chǎng)倒置熒光顯微鏡結(jié)合使用。然而，在這些技術(shù)中，物鏡都是特殊的，無(wú)論是相位環(huán)還是霍夫曼調(diào)制板，都會(huì)導(dǎo)致5-15%的發(fā)射強(qiáng)度損失。
需要注意的是，當(dāng)將DIC、相差或霍夫曼調(diào)制對(duì)比與熒光結(jié)合時(shí)，尤其是在活細(xì)胞成像中，通過(guò)DIC偏光器、物鏡相位環(huán)或物鏡后焦平面上的霍夫曼調(diào)制板的發(fā)射光損失可能很?chē)?yán)重。在前一種情況下，在采集熒光圖像之前，應(yīng)將DIC偏光器和Nomarski棱鏡從光路中移除，但相差物鏡和霍夫曼物鏡包含不能移除的光學(xué)元件。通過(guò)相位環(huán)或霍夫曼調(diào)制器的光損耗不如通過(guò)偏光器的光損耗嚴(yán)重，并且不會(huì)影響許多應(yīng)用。然而，在使用弱熒光探針染色或具有低豐度目標(biāo)的樣本中，使用高透過(guò)率物鏡獲得靈敏度增益是至關(guān)重要的。