高效液相色譜儀(HPLC)是分析實(shí)驗(yàn)室常用的測(cè)試儀器之一，其應(yīng)用越來(lái)越廣泛。此種儀器在使用過(guò)程中，難免會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問(wèn)題，并將直接影響到所測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和儀器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因，即可清楚預(yù)防和排除這些故障的方法，就可正確地使用儀器并大限度地發(fā)揮儀器的性能。今天我們要從以下幾個(gè)方面和您分享下在使用高效液相色譜儀中需注意的幾個(gè)問(wèn)題。

一、使用試管的問(wèn)題

1、試管的潔凈問(wèn)題。

高效液相色譜分析法是一個(gè)很靈敏的分析方法，如果因使用不潔凈的試管，便會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。例如，在用甲醇作溶劑來(lái)溶解樣品時(shí)，所用的小試管是用橡膠塞來(lái)做蓋子的，因此，在每次進(jìn)樣時(shí)，都有一個(gè)保留時(shí)間固定的干擾峰存在，后經(jīng)證實(shí)，此干擾峰是由甲醇浸泡橡膠塞而溶下的組分所產(chǎn)生，換用玻璃試管后，干擾峰消除。

2、塑料試管的溶解問(wèn)題。

近年來(lái)，一次性塑料試管給試驗(yàn)人員帶來(lái)了極大的方便，但是，在使用過(guò)程中一定要注意有機(jī)溶劑對(duì)試管的溶解現(xiàn)象，在利用此種試管提取樣品時(shí)，有些有機(jī)溶劑(如綠 fang等)對(duì)管壁有溶解現(xiàn)象，這些被溶解下來(lái)的物質(zhì)有時(shí)也能在檢測(cè)器上產(chǎn)生信號(hào)，從而干擾樣品的測(cè)定。這時(shí)，可用相同的實(shí)驗(yàn)條件先行試驗(yàn)一下，看看不含被抽提物時(shí)，提取液在檢測(cè)器上能否產(chǎn)生干擾信號(hào)，如確有干擾信號(hào)存在，就只能換用耐有機(jī)溶劑的玻璃試管了。

3、被測(cè)樣品在試管壁上的吸附問(wèn)題。

這個(gè)問(wèn)題也應(yīng)引起注意，否則也會(huì)影響測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性，在治療藥物監(jiān)測(cè)(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中，有些被測(cè)藥物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃試管的管壁上，因此，操作中宜采用聚丙烯管，為防止提取中吸附現(xiàn)象的發(fā)生，可采用0.5%的已二胺已烷液做為提取劑，可有效地防止吸附。

二、操作進(jìn)樣閥的問(wèn)題

目前，在分析型高效液相色譜儀中常用的進(jìn)樣閥是7725型進(jìn)樣閥，其內(nèi)部的六通閥結(jié)構(gòu)使進(jìn)樣操作非常方便，但是，如果使用不當(dāng)，也會(huì)帶來(lái)問(wèn)題。例如，在高效液相色譜法的試驗(yàn)過(guò)程中，有時(shí)會(huì)有異常色譜峰的出現(xiàn)以及重現(xiàn)性不好的問(wèn)題，這主要是由于操作方法不當(dāng)所引起，要想解決此類問(wèn)題，需從以下幾個(gè)方面入手。

1、進(jìn)樣量的控制。

用進(jìn)樣閥來(lái)進(jìn)樣時(shí)，閥內(nèi)的樣品環(huán)是定量的，(一般分析型進(jìn)樣閥的樣品環(huán)體積為20ul)，由于進(jìn)樣時(shí)，注射到進(jìn)樣閥內(nèi)的樣品溶液在樣品環(huán)的管路中有徑向的速度梯度(即管軸處比管壁處的液流速度快)。因此，要想使樣品環(huán)中充滿樣品溶液，從而使用進(jìn)樣閥來(lái)準(zhǔn)確地定量，則必須使進(jìn)樣量大于樣品環(huán)體積的2倍。如果用注射器來(lái)控制進(jìn)樣量，則大只能注射樣品環(huán)體積1/2的量，這樣才能防止部分樣品由溢流管溢出從而導(dǎo)致定量分析的誤差。

2、進(jìn)樣閥的清潔問(wèn)題。

如果樣品環(huán)中有上次進(jìn)樣時(shí)樣品的殘留，必然會(huì)污染下次注射進(jìn)的樣品，為防止這種現(xiàn)象的發(fā)生，應(yīng)按下列步驟操作：a.進(jìn)樣閥有2個(gè)位置，INJECT和LOAD。首先在LOAD位置時(shí)，以注射器將流動(dòng)相注入進(jìn)樣閥內(nèi)清洗幾次，每次用量大約40ul；b.然后將進(jìn)樣閥板手扳至INJECT位置時(shí)，再以流動(dòng)相清洗幾次，每次用量還是40ul；c.后，再將樣品注射到進(jìn)樣閥里。

按照上述的步驟操作，可以避免由進(jìn)樣閥引起的污染，從而使干擾峰消除并提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3、進(jìn)樣閥溢流管的堵塞。

有時(shí)，進(jìn)樣閥的溢流管會(huì)發(fā)生堵塞現(xiàn)象，向進(jìn)樣閥內(nèi)注射樣品時(shí)，注射針推不動(dòng)。此故障是由于溢流管的堵塞所致。堵塞的原因多半是由于溶解樣品的流動(dòng)相用的是鹽溶液，而其中的鹽在溢流管的排空端口處結(jié)晶所致。此時(shí)，可用小燒杯盛少量蒸餾水對(duì)溢流管口稍加浸泡，端口處鹽的結(jié)晶就能被溶解掉，故障排除。如能在每次進(jìn)樣完成之后，用蒸餾水反復(fù)沖洗至溢流管中的鹽分全部沖出，則可避免此故障的發(fā)生。

三、流動(dòng)相(MOBLLE PHASE)的問(wèn)題

甲醇和乙腈在高效液相色譜分析法中常常被用來(lái)配制流動(dòng)相。高效液相色譜法中常用的試劑是高等級(jí)的試劑，如色譜純?cè)噭Ｔ谝蟛惶珖?yán)格時(shí)，優(yōu)級(jí)純甚至分析純的試劑也能用。高效液相色譜分析法中常用的是紫外檢測(cè)器，因此，從降低基線噪音和提高分析靈敏度上來(lái)考慮，應(yīng)該使用紫外吸收小且雜質(zhì)含量少的色譜純?cè)噭?/p>

1、流動(dòng)相的過(guò)濾。

配制好的流動(dòng)相在使用前一定要先用0.5um孔徑的微孔濾膜來(lái)過(guò)濾。這是因?yàn)槿芤褐泻泻芏嗳庋垭y以發(fā)現(xiàn)的微小顆粒，如果不把它們?yōu)V除掉，就會(huì)堵塞泵口、柱頭上的過(guò)濾器，這樣就堵塞了流動(dòng)相的正常通道，使色譜柱的阻力增加，柱壓升高，柱效下降。碰到這種情況時(shí)，要換用經(jīng)過(guò)濾的流動(dòng)相，并將堵塞的濾器拆下來(lái)浸泡在20%的硝酸水溶液中以超聲波清洗機(jī)清洗20分鐘，以除去濾片上的堵塞物。

2、流動(dòng)相的脫氣。

流動(dòng)相在使用前必須脫氣，以盡可能的除去溶解在流動(dòng)相中的氣體，否則，這些氣體會(huì)使柱填料的性能降低，還能夠?qū)z測(cè)器的信號(hào)產(chǎn)生很大的干擾。脫氣有多種方法，如超聲脫氣、真空脫氣、氮?dú)饷摎獾?。真空脫氣法和氮?dú)饬髅摎夥ㄊ悄壳俺Ｊ褂玫拿摎夥āＫ图状蓟旌虾髸?huì)產(chǎn)生大量的氣泡，如果不脫氣就使用，氣泡就會(huì)進(jìn)入色譜柱和檢測(cè)器，并將影響分析工作的正常進(jìn)行。 

四、色譜柱的使用和保養(yǎng)

 色譜柱是高效液相色譜儀主要的部件，被測(cè)物質(zhì)能否被很好的分離和測(cè)定，色譜柱的性能起著決定性的作用。因此，在日常工作中，應(yīng)特別注意色譜柱的正確使用和維修保養(yǎng)，以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。

1、使用預(yù)柱和保護(hù)柱。

預(yù)柱(pre-column)安裝于泵和進(jìn)樣器之間，它給色譜柱中的流動(dòng)相提供了*的平衡，并防止了對(duì)柱填料有破壞作用的組分或污染物進(jìn)入色譜柱。保護(hù)柱(guard column)可以阻擋能夠牢固地吸附于色譜柱上的組分進(jìn)入色譜柱，保護(hù)柱應(yīng)與色譜柱的填料相同。預(yù)柱和保護(hù)柱可以經(jīng)常更換，而不需要經(jīng)常更換色譜柱，這就延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命。

2、防止氣體進(jìn)入色譜柱。

有些色譜柱(如凝膠柱)是不允許氣泡進(jìn)入的，否則將會(huì)使柱效降低甚至形成微小的難以驅(qū)除的氣室。因此，為了防止氣泡進(jìn)入色譜柱，一定要使用經(jīng)過(guò)脫氣的流動(dòng)相，并且要嚴(yán)格按照下列步驟來(lái)安裝色譜柱。a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲，觀察是否有溶劑滲出；b.如有溶劑滲出，即可將色譜柱接到管路上，以避免氣泡的進(jìn)入；c.如無(wú)溶劑滲出時(shí)，表明色譜柱的此端已經(jīng)進(jìn)去空氣了，此時(shí)，可將色譜柱的出口端接到進(jìn)樣閥上，以流動(dòng)相來(lái)反方向沖洗色譜柱，以便將柱內(nèi)的空氣排除。建議以0.2ml/min的小流量來(lái)沖色譜柱，如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會(huì)導(dǎo)致柱性能的降低；d.如果流出的溶劑里不含有氣泡，說(shuō)明柱內(nèi)的氣體已經(jīng)被排出了，再將色譜柱以正確的方向接好，這樣氣泡就進(jìn)不到色譜柱里面了。

3、色譜柱的清洗。

為了不使被測(cè)物質(zhì)和雜質(zhì)停留在色譜柱中，在每次的樣品分析工作完成之后，都應(yīng)及時(shí)地清洗色譜柱。首先要用對(duì)被測(cè)樣品洗脫能力強(qiáng)的溶劑來(lái)洗脫色譜柱，以分析工作中常用的反相色譜分析法為例，因其先流出的物質(zhì)是極性大的物質(zhì)，此時(shí)應(yīng)用100%的甲醇或使用異丙純、四qing fu 南等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內(nèi)的極性小的物質(zhì)洗脫下來(lái)，洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。如果流動(dòng)相是緩沖溶液，則應(yīng)先用蒸餾水來(lái)沖洗色譜柱，以沖掉柱內(nèi)的鹽，然后再用合適的溶劑來(lái)沖洗。

凝膠濾過(guò)色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動(dòng)相，用完之后當(dāng)然要用蒸餾水來(lái)沖洗。如果是連續(xù)操作，可以將緩沖溶液置于柱內(nèi)過(guò)夜，但是維持小流速(＜0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出，如果流動(dòng)相中含有鹵化物，即使是停一夜，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈，以防止它們對(duì)柱體的腐蝕。

4、色譜柱的存放。

如果色譜柱暫時(shí)不用，存放時(shí)要注意以下幾點(diǎn)：

a.幾天之內(nèi)的短期放置，應(yīng)先用溶劑沖洗好色譜柱(如凝膠柱則用蒸餾水來(lái)沖洗)，再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可。

b.如果色譜柱長(zhǎng)期不用，僅用上述方法來(lái)處理就不行了，這時(shí)應(yīng)使用色譜柱使用說(shuō)明書中所指明的溶劑來(lái)充滿色譜柱，反相柱一般使用甲醇，正相柱則可用正已烷或庚烷，而凝膠柱則不能用水了，因柱內(nèi)如果有微生物的生長(zhǎng)則會(huì)使柱效降低，此時(shí)應(yīng)用0.05%的NaNs水溶液(防腐劑)來(lái)沖洗色譜柱，再將色譜柱封嚴(yán)。色譜柱長(zhǎng)期放置時(shí)，一定要將色譜柱的兩端封嚴(yán)，以防止由于溶劑揮發(fā)而造成的柱填料干縮現(xiàn)象，因這可導(dǎo)致柱效的嚴(yán)重降低。

c.色譜柱應(yīng)貯存在室溫下，如果放置于0℃以下的環(huán)境里，柱內(nèi)就會(huì)結(jié)冰，這也將導(dǎo)致柱效的降低。

五、色譜峰的雙峰問(wèn)題

長(zhǎng)期使用后的色譜柱，如果有雜質(zhì)進(jìn)入，就會(huì)使色譜柱入口處的固定相“板結(jié)”并在流動(dòng)相所產(chǎn)生的高壓作用下，形成柱頭的塌陷，被分析的樣品組分的正常色譜峰就變成了雙峰，這時(shí)可按下述方法來(lái)修復(fù)色譜柱。首先將柱頭的緊固螺母旋下，這時(shí)就會(huì)發(fā)現(xiàn)柱頭內(nèi)的固定相已被壓縮進(jìn)去了，嚴(yán)重時(shí)可縮進(jìn)10mm以上。在這種情況下，我們可用針尖將流動(dòng)相表層板結(jié)變黃的部分摳掉，并以相同的固定相將此塌陷區(qū)填平、壓實(shí)，再將色譜柱的緊固螺絲上緊，修復(fù)工作即告結(jié)束。用經(jīng)過(guò)修復(fù)后的色譜柱再做樣品時(shí)，色譜峰就恢復(fù)正常了。

以上從幾個(gè)方面簡(jiǎn)介了色譜儀的正確使用及故障排除方法。在日常工作中，如果能對(duì)這些事項(xiàng)認(rèn)真對(duì)待，做到有問(wèn)題及時(shí)解決，則會(huì)大大延長(zhǎng)儀器的正常使用期限，并使儀器的性能得到大限度的發(fā)揮。

六、常見(jiàn)故障及處理

故障1：流動(dòng)相內(nèi)有氣泡

流動(dòng)相內(nèi)有氣泡，關(guān)閉泵，打開(kāi)排空閥，按PURGE鍵清洗脫氣，氣泡不斷的從過(guò)濾器冒出，進(jìn)入流動(dòng)相，無(wú)論打開(kāi)PURGE鍵幾次，都無(wú)法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。 

原因：

過(guò)濾器長(zhǎng)期沉浸于水液內(nèi)，過(guò)濾頭內(nèi)部由于霉菌的生長(zhǎng)繁殖，形成菌團(tuán)阻塞了過(guò)濾器，緩沖液難以流暢的通過(guò)過(guò)濾頭，空氣在泵的壓力下經(jīng)過(guò)過(guò)濾器進(jìn)入流動(dòng)相.處理過(guò)濾頭浸泡在5%的硝酸溶液內(nèi)，超聲清洗十五分鐘即可；亦可將過(guò)濾頭浸泡在5%的硝酸溶液中12～36小時(shí)，輕輕震蕩幾次，再將過(guò)濾器用純水清洗幾次，打開(kāi)排空閥，打開(kāi)PURGE鍵清洗脫氣如仍有氣泡不斷從過(guò)濾器冒出，繼續(xù)將過(guò)濾器浸泡在5%硝酸溶液中，如沒(méi)有氣泡不斷從過(guò)濾器冒出，說(shuō)明過(guò)濾器內(nèi)部的霉菌菌團(tuán)以被硝酸破壞，流動(dòng)相可以流暢的通過(guò)過(guò)濾器，打開(kāi)排空閥，打開(kāi)泵流速調(diào)治1.0～3.0mL/min，純水沖洗過(guò)濾器1小時(shí)左右，即，可將過(guò)濾器清洗干凈。關(guān)閉泄壓閥，純甲醇沖洗半小時(shí)即可。

故障2：柱壓高

原因：

(1)緩沖液鹽份如，乙酸銨等，沉積柱內(nèi)；

(2)樣品污染沉積。

處理：

對(duì)于No1的情況先用40～50度的純水，低速正向沖洗柱子待柱壓逐漸下降后，相應(yīng)的提高流速?zèng)_洗柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘，對(duì)于第2種情況，由樣品的沉積引起污染的C18柱，和純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇[4+6]沖洗柱子[沖洗時(shí)間的長(zhǎng)短由樣品的污染情況而定]，在用換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，后甲醇沖洗，正向沖洗柱子30分鐘以上。

故障3：既無(wú)壓力指示又無(wú)液體流過(guò)

原因：

1.泵密封墊圈磨損；

2.大量氣體進(jìn)入泵體。

處理：

對(duì)于No1的情況,更換密封墊圈，對(duì)于第二種情況,在泵作用的同時(shí)，用一個(gè)50mL的玻璃針筒在泵的出口處不幫助抽出空氣。

故障4：壓力波動(dòng)大，流量不穩(wěn)定

原因：

系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間家有異物，使得兩者不能密封；

處理：

工作中注意流動(dòng)相的量，保證不銹鋼濾器沉入儲(chǔ)液器瓶底，避免吸入空氣，流動(dòng)相要充分脫氣，如，為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。

故障5：出峰不準(zhǔn)，峰分叉

原因：

(1)色譜柱被污染；

(2)柱頭填料塌陷。

處理：

對(duì)于No1的情況,先用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長(zhǎng)短由樣品污染的情況而定)，再換成甲醇沖洗，然后，再用純水沖洗，后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上，如，沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。對(duì)于第二種情況，擰開(kāi)柱頭，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷，去除硬結(jié)部分(污染的填料)，裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與助內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上。

故障6：峰面積重復(fù)性不佳

原因：

（1）進(jìn)樣閥漏夜； 

（2）加樣針不到位：

處理：

對(duì)于No1的情況更換進(jìn)樣墊圈；對(duì)于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速，平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT狀態(tài)，以保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確。日常生活中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要，如要注意不要讓空氣進(jìn)入輸液系統(tǒng)和高壓泵中，儲(chǔ)液器內(nèi)的溶液如時(shí)間未用應(yīng)清洗儲(chǔ)液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖溶液要用純水沖洗干凈，防止無(wú)機(jī)鹽析出或沉積；樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì)，*溶解，盡量減少對(duì)色譜柱的污染，以延長(zhǎng)色譜住的使用壽命，同時(shí)，避免注射過(guò)量濃的樣品溶液，以免殘留液在進(jìn)樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞；色譜住作好標(biāo)記，用于不同分析目的的色譜住不要混用等。