光學(xué)顯微鏡技術(shù)是研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)zui重要的工具，在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用。近年來，隨著多種現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)與光鏡技術(shù)的結(jié)合，使光學(xué)顯微鏡展示出更新的活力。目前光學(xué)顯微鏡已發(fā)展成多種類型，用于各類不同的研究目的。在細(xì)胞生物學(xué)中常用的有普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、相差顯微鏡，以及暗視野顯微鏡和微分干涉差顯微鏡。 
（一）普通光學(xué)顯微鏡技術(shù) 
普通光學(xué)顯微鏡（簡稱光鏡）是zui常使用的顯微鏡，主要由三部分組成：聚光鏡、物鏡和目鏡。光鏡采用可見光作光源，分辨率為0.2µm，放大倍率為1000倍，其他幾種顯微鏡都是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。 
用于普通光學(xué)顯微鏡觀察的生物樣品必須應(yīng)過一系列的組織處理并制成1～10µm的切片。常規(guī)的樣品制備方法是：甲醛固定，酒精脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精（hematoxylin）和伊紅（eosin）染色，光鏡觀察。 
普通光學(xué)顯微鏡能觀察染色的生物標(biāo)本的結(jié)構(gòu)，主要是因為光線通過染色標(biāo)本時其顏色（光波的波長）和亮度（光波的振幅）發(fā)生變化，人的眼睛才能觀察到。 
（二）熒光顯微鏡技術(shù) 
熒光顯微鏡（fluorescentmicroscope）是以各種特定波長光源激發(fā)生物標(biāo)本中的熒光物質(zhì)，產(chǎn)生各種可見顏色熒光的一種顯微鏡。熒光顯微鏡一般采用高壓汞燈和弧光燈作為光源，在光源和反光鏡之間放一組濾色片以產(chǎn)生特定波長的激發(fā)光，光譜一般從紫外到紅外，從而激發(fā)各種熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同波長的發(fā)射光。利用熒光顯微鏡可研究熒光物質(zhì)在組織和細(xì)胞內(nèi)的分布，以達(dá)到對細(xì)胞的特定物質(zhì)進(jìn)行定性、定位和定量觀察的目的。與生物學(xué)有關(guān)的熒光現(xiàn)象有三種： 
⑴自發(fā)熒光通過激發(fā)光會使物體發(fā)出熒光，如葉綠素、維生素A等。 
⑵誘發(fā)熒光通過誘導(dǎo)劑作用而發(fā)的熒光，如甲醛蒸氣處理可誘發(fā)細(xì)胞和組織中生物單胺類產(chǎn)生熒光。 
⑶熒光染料染色熒光例如吖啶橙可以對細(xì)胞DNA、RNA同時染色，顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙色熒光。熒光染料可和抗體共價鍵結(jié)合，這種標(biāo)記的抗體再和相應(yīng)的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)激發(fā)后發(fā)射熒光進(jìn)行抗原定位。 
由于熒光顯微鏡技術(shù)染色簡便、敏感度高而且圖像色彩鮮明，所以是目前對特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性、定位的有力的工具。 
（三）相差顯微鏡技術(shù) 
相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）是一種可以觀察活細(xì)胞或未經(jīng)染色的標(biāo)本的顯微鏡。相差顯微鏡能夠改變直射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變成振幅差（明暗差），同時它還吸收部分直射光線以增大其明暗反差。因此可以觀察活細(xì)胞或未經(jīng)染色的標(biāo)本。 
相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要區(qū)別是在物鏡后裝有一塊“相差板”，偏轉(zhuǎn)的光線分別通過相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質(zhì)，所以又使兩組光線之間增加了新的光程差，從而對樣品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。zui后這兩組光線經(jīng)過透鏡又會聚成一束，發(fā)生互相疊加或抵消的干涉現(xiàn)象，從而表現(xiàn)出肉眼明顯可見的明暗區(qū)別。 
觀察活體細(xì)胞常采用倒置相差顯微鏡，它與一般相差顯微鏡的不同是光源和聚光器裝在上方，相差物鏡裝在載物臺下方，便于觀察在培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，這樣可清楚地分辨細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞核、核仁以及胞質(zhì)中存在的顆粒，甚至研究細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的動態(tài)。 
（四）微分干涉差顯微鏡技術(shù) 
微分干涉差顯微鏡（differentialinterferencecontrast）又稱Nomarski相差顯微鏡，其優(yōu)點是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，標(biāo)本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。 
微分干涉差顯微鏡利用的是偏振光，這些光經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然后在經(jīng)過另一棱鏡將這兩束光匯合，從樣品中厚度上的微小區(qū)別就會轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差并且具有很強的立體感。 
微分干涉顯微鏡能使細(xì)胞核及較大的細(xì)胞器如線粒體等具有較強的立體感，比較適合于顯微操作。目前多用于基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因動物等生物工程的顯微操作。將微分干涉差顯微鏡接上錄象機，可以觀察活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運動。 
（五）激光掃描共焦顯微鏡 
激光掃描共焦顯微鏡（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM），也被稱為激光掃描細(xì)胞儀（laserscanningcytometer，LSC）。自20世紀(jì)70年代問世以來很快得到迅速發(fā)展，成為分子細(xì)胞生物學(xué)的新一代研究工具。激光掃描共焦顯微鏡在顯微鏡基礎(chǔ)上配置激光光源，掃描裝置，共扼聚焦裝置和檢測系統(tǒng)，整套儀器均由計算機自動控制，軟件監(jiān)控和執(zhí)行各組件之間的切換。生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中LSCM的顯微鏡以倒置顯微鏡為主，便于活細(xì)胞檢測。與普通光鏡和熒光顯微鏡相比有一些明顯的優(yōu)點，其中主要有： 
（1）普通顯微鏡使用的光源為鹵素?zé)?，光譜范圍寬，成象時樣品上每個照光點均 
會受到色差影響以及由照射光引起的散射和衍射的干擾，影響成象質(zhì)量。LSCM的光源為激光，是單色性好的平行光，基本消色差，成象聚焦后焦深小，縱向分辨率高，可無損傷地對樣品作不同深度的層掃描和熒光強度測量。 
（2）普通熒光顯微鏡分辨率低，顯示的圖象結(jié)構(gòu)為多層面的圖象迭加，結(jié)構(gòu)不夠 
清晰。LSCM結(jié)構(gòu)上采用雙針孔（pinhole）裝置，形成物象共扼的*設(shè)計（如圖2－2所示）。激光通過聚光鏡焦平面上針孔形成點光源經(jīng)物鏡在焦平面上對樣品進(jìn)行逐點掃描，樣品上每個照射點，反射后經(jīng)過物鏡折射到像焦平面的探測針孔處成像，經(jīng)空間濾波后，有效地抑制同焦平面上非測量光點形成的雜散熒光和樣品的不同焦平面發(fā)射來的干擾熒光。每個像點被光電倍增管（PMT）或冷電感藕合器件（cCCD）探測器接收。因為光學(xué)系統(tǒng)物象共扼，只有物鏡焦平面上的點經(jīng)針孔空間濾波才能形成光點圖象，掃描后可得到信噪比*的光學(xué)橫斷面，分辨率比普通光學(xué)顯微鏡提高1.4倍。LSCM能以0.1um的步距沿軸向?qū)?xì)胞進(jìn)行分層掃描，得到一組光學(xué)切片，不同焦平面的光學(xué)切片經(jīng)三維重建后能得到樣品的三維立體結(jié)構(gòu)，這種功能被形象地稱為"顯微CT"。 
（3）LSCM的高靈敏度、高分辨率和高放大倍數(shù)，減少了光淬滅的影響，提供了 
普通光學(xué)顯微鏡無法顯示的結(jié)構(gòu)信息，并適用于達(dá)到毫秒級的快速變化檢測。 
LSCMzui常用的功能是熒光檢測、三維重建和顯微操作等。其中熒光檢測覆蓋的內(nèi)容極為廣泛，通過多種熒光探針或熒光連接抗體，可對細(xì)胞內(nèi)離子、pH值、各種蛋白質(zhì)分子進(jìn)行動態(tài)測定。另外利用激光掃描還可以對細(xì)胞進(jìn)行特殊操作，例如光刀切割法（cookie-cutter）作粘附細(xì)胞分選（adheredcellsorting），能殺滅不需要的細(xì)胞，保留所選細(xì)胞亞群繼續(xù)培養(yǎng)；激光光陷阱技術(shù)（又稱為光鑷技術(shù)）對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行非接觸式的捕獲和固定，并進(jìn)行操作；激光作為光子刀可以用來完成細(xì)胞膜瞬間打孔以及對線粒體、溶酶體、染色體和神經(jīng)元突起的切割等顯微細(xì)胞外科手術(shù)。

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