細(xì)胞凋亡羅丹明123染色試劑盒
(Cell Apoptosis Rhodamine 123 Detection Kit)
Store at-20℃ for one year
Expire date:
一、試劑盒說明
羅丹明123(Rhodamine 123)是一種可透過細(xì)胞膜的陽(yáng)離子熒光染料,是一種線粒體跨膜電位的指示劑。其在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì),熒光強(qiáng)度減弱或消失。而在凋亡發(fā)生時(shí),線粒體膜完整性破壞,線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放,引起線粒體跨膜電位(ΔΨm) 的崩潰, Rh123 重新釋放出線粒體, 從而發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光,可用熒光顯微鏡、熒光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè),通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來檢測(cè)線粒體膜電位的變化和凋亡的發(fā)生。
本試劑盒適用于培養(yǎng)的細(xì)胞或從組織中提取出的線粒體的膜電位檢測(cè)。
二、試劑盒組份
組分 | KGA217(100 assays) | 儲(chǔ)存條件 |
羅丹明123染液(1 mg/mL) | 1 mL | -20℃ |
5×Assays Buffer | 20 mL | -20℃ |
備注:1×Assays Buffer工作液配制:用前將5×Assays Buffer 用雙蒸水稀釋5倍。
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
流式細(xì)胞儀、熒光光度計(jì)或熒光顯微鏡:
激發(fā)波長(zhǎng)488~505nm,發(fā)射波長(zhǎng)515~575 nm (一般為530nm);
線粒體提取試劑(可選購(gòu)凱基線粒體提取試劑盒,CAT NO:KGA827)及儀器;
5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、微量移液器、1.5m L Microtube、載玻片
四、操作方法
1.細(xì)胞染色及分析
(1)培養(yǎng)細(xì)胞1×106/mL重懸于培養(yǎng)基中;
(2)加入羅丹明123染液0.1μg/mL~50 μg/mL (根椐細(xì)胞種類不同而濃度不同,一般3~10 μg/mL);
(3)37℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1~30 min(根椐細(xì)胞種類不同而不同,一般10 min);
(4)離心以培養(yǎng)基洗細(xì)胞兩次;
(5)重懸細(xì)胞于培養(yǎng)基中,37℃,5% CO2培養(yǎng)60 min;
(6) 流式細(xì)胞儀檢測(cè):激發(fā)波長(zhǎng)488~505nm,發(fā)射波長(zhǎng)515~575 nm (一般為530nm);
熒光顯微鏡觀察:滴加100μL上述混合液于載玻片上,激發(fā)濾光片波長(zhǎng)488nm,阻斷濾光片波長(zhǎng)515nm觀察,拍照。
2. 組織提取的線粒體染色及分析
(1)按常規(guī)方法提取的線粒體,用適量的1×Assays Buffer(將5×Assays Buffer 用雙蒸水稀釋5倍)重懸;
(2)常規(guī)方法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定后,用1×Assays Buffer調(diào)配成3mg/mL的線粒體溶液;
(3)取2mL 1×Assays Buffer和1mL線粒體溶液;
(4)加入適量待測(cè)化合物(同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組),250C保溫3 min;
(5)加入羅丹明123染液10μL;
(6) 熒光光度計(jì)檢測(cè):上述混合液全部加入石英比色皿中,置于250C下測(cè)定,激發(fā)波長(zhǎng)488~505nm,發(fā)射波長(zhǎng)530nm,連續(xù)記錄從0 min~30 min內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化。