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7-AAD （7-amino-actinomycin D）是一種核酸染料，它不能通過正常質(zhì)膜，隨著細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡過程，質(zhì)膜對7-AAD的通透性逐漸增加，結(jié)合細(xì)胞凋亡中DNA的有控降解，在合適波長激發(fā)光的激發(fā)下可發(fā)出明亮的紅色熒光，通過7-AAD標(biāo)記DNA的強(qiáng)弱，將細(xì)胞分為三群：7-AAD強(qiáng)為死亡細(xì)胞，7-AAD弱是凋亡細(xì)胞，7-AAD-為正?；盍?xì)胞。7-AAD同PI 有著相似的熒光特性，但其發(fā)射波譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI 的*替代品，可與Annexin V-EGFP/FITC/PE聯(lián)合使用。

本試劑盒適用于培養(yǎng)的細(xì)胞染色，可應(yīng)用于熒光顯微鏡、激光共聚焦計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測。

二、試劑盒組份

組分	KGA219（100 assays）	儲存條件
7-AAD染液	0.5 mL	4℃,避光
10×Assays Buffer	5 mL	4℃

1×Assays Buffer工作液配制：用前將10×Assays Buffer 用雙蒸水稀釋10倍。

三、試劑盒以外自備儀器和試劑

流式細(xì)胞儀、激光共聚焦或熒光顯微鏡：激發(fā)波長546nm，發(fā)射波長647 nm

微量移液器、1.5m L Microtube、載玻片

四、使用注意事項(xiàng)

1．微量試劑取用前請離心集液。

2． 7-AAD避光保存及使用。

3． 7-AAD為潛在致癌物，操作時(shí)請采取防護(hù)措施，穿防護(hù)服、戴手套等。

4．本試劑盒適用于檢測活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測時(shí)，細(xì)胞數(shù)量不以應(yīng)低于1×10⁵^，，不*用于檢測組織樣本。

五、操作方法

1．懸浮細(xì)胞離心（2000rpm離心5min）收集；貼壁細(xì)胞用胰酶消化收集用PBS洗滌細(xì)胞二次（2000rpm離心5min）收集1~5×10⁵細(xì)胞；

2．加入5μL 7-AAD染液，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15min；

3．加入500μL的1×Assays Buffer懸浮細(xì)胞；

4．請?jiān)?/span>1 hour內(nèi)，進(jìn)行下述熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。

A． 熒光顯微鏡觀察

1．滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞；

2．對于貼壁細(xì)胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；

（1）將細(xì)胞于蓋玻片上生長，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對照組；

（2）用PBS洗滌細(xì)胞兩次；

（3）在500μL 的1×Assays Buffer中加入5μL7-AAD染液，混勻；

（4）將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；

（5）避光、室溫反應(yīng)5 min。

3．將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察激發(fā)波長546nm，發(fā)射波長647 nm，7-AAD熒光信號呈紅色。

B． 流式細(xì)胞儀分析

用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=546 nm; 發(fā)射波長Em=647 nm。

7-AAD紅色熒光建議使用FL3通道檢測。

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