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TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（FITC標(biāo)記POD法）是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞在凋亡過(guò)程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況，其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂的DNA的3^‘－OH末端，可用熒光顯微鏡檢測(cè)；熒光素亦可被抗熒光素抗體（anti-fluorescein antibody）標(biāo)記,，在辣根過(guò)氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）的存在下，產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在普通光學(xué)顯微鏡下即可觀察和計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被標(biāo)記或染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟切片）的凋亡原位檢測(cè)。

本試劑盒特點(diǎn)

●操作簡(jiǎn)便：使用Ready-to-Use型試劑，并配有Proteinase K和DAB。

● 高靈敏度：可以單一檢出初期的凋亡細(xì)胞。

● 高特異性：能特異性染色凋亡細(xì)胞。

●快速操作：整體操作約需3小時(shí)。

● 方便觀察：可使用熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，亦可在信號(hào)轉(zhuǎn)換后使用光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

● 高正確性：有陽(yáng)性對(duì)照片的制備方法，可以確認(rèn)試劑盒的有效性

二、TUNEL試劑盒組分

組份	Cat: KGA-7025 20 assays	Cat: KGA-7035 50 assays	Cat: KGA-7045 100 assays	儲(chǔ)存條件
Equilibration Buffer	1.0 mL	2.5 mL	5.0 mL	-20℃
FITC-12-dUTP	20μL	50μL	100μL	-20℃
TdT Enzyme	80μL	200μL	400μL	-20℃
50×Proteinase K	40μL	100μL	200μL	-20℃
anti-fluorescein antibody	200μL	500μL	1000μL	-20℃
DAB	2mg	5mg	10 mg	-20℃

注意事項(xiàng)

1．使用前請(qǐng)認(rèn)真閱讀本說(shuō)明書(shū)，提前準(zhǔn)備好相關(guān)試劑。

2．因本試劑盒中組分均為微量，使用前請(qǐng)離心集液。

3．為避免試驗(yàn)誤差、降低試劑的損耗，建議使用精密度高的進(jìn)口微量移液槍及槍頭。

4．TdT 酶反應(yīng)液在使用前根椐樣本數(shù)量集中配制，再分別滴加于各樣本片上，避免每個(gè)樣本單獨(dú)配制而產(chǎn)生的試劑損耗。

5．另因DAB為固體粉末，使用前加入適量PBS溶解，配制成20×DAB（10 mg/ml）后，按下述方法顯色使用。

6．用戶(hù)自備：多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、檸檬酸鈉、復(fù)染蘇木素染液、蓋玻片、載玻片、染色缸。

三、檢測(cè)樣本的預(yù)處理

TUNEL檢測(cè)時(shí)樣本的預(yù)處理是試驗(yàn)的關(guān)鍵所在，本說(shuō)明書(shū)*的條件僅為普遍情況，用戶(hù)需根椐自已的樣本材料及*試驗(yàn)結(jié)果來(lái)調(diào)整各個(gè)條件，如處理時(shí)間、處理濃度等（參照Page 9），來(lái)優(yōu)化出適合自身樣本的試驗(yàn)條件，從而做出客觀的試驗(yàn)結(jié)果。

1． 常規(guī)石蠟組織切片的預(yù)處理

* 注意事項(xiàng)：蛋白酶K處理的使用濃度、處理時(shí)間及溫度，都因組織的類(lèi)型不同而有所不同，需要自已摸索優(yōu)化上述條件，如有問(wèn)題，請(qǐng)根椐本說(shuō)明書(shū)Page 9的《常見(jiàn)問(wèn)題的原因及*解決方案》來(lái)調(diào)整條件。例如：如果凋亡細(xì)胞染色較弱時(shí)，可用高濃度的Proteinase K（400μg/mL）處理5分鐘（本試劑盒的50×Proteinase K濃度為1mg/mL）。

其它替代方法：石蠟切片的預(yù)處理也可根椐實(shí)際情況可采用下述三種替代方法之一，即蛋白酶K處理的步驟改用下述方法，其余步驟均相同：

替代方法1: 將脫蠟及水合好的切片浸入通透液中8～10 min（通透液：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配制）

替代方法2：將脫蠟及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中15～60 min（胃蛋白酶：0.25%～0.5%溶于HCl pH2，胰蛋白酶0.25%～0.5%溶于0.01N HCl ）

替代方法3: 將脫蠟及水合好的切片浸入含200ml 0.1M 、PH 6的檸檬酸緩沖液的塑料盒中，置于微波爐中350W（低檔）處理5 min。

2． 其它難于處理的組織切片的預(yù)處理

3． 陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照的準(zhǔn)備

TUNEL檢測(cè)同時(shí)需要設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，以顯示試驗(yàn)的客觀性及準(zhǔn)確性。因此需要按下述方法準(zhǔn)備兩個(gè)樣本來(lái)制備陽(yáng)性及陰性片，其后續(xù)步驟與待測(cè)樣本同樣進(jìn)行。

A：陽(yáng)性對(duì)照樣本的準(zhǔn)備

組織樣本在蛋白酶K處理、PBS浸洗后，再加入100μL DNase I反應(yīng)液（10U～3000U DNase I，40mM Tris-HCl PH 7.9,10 mM NaCl, 6mM MgCl₂, 10mM CaCl₂）（用戶(hù)自備）

室溫～37℃處理10～30 min，其余步驟均相同。如有問(wèn)題詳見(jiàn)Page 9.

B：陰性對(duì)照樣本的準(zhǔn)備

在Page 7標(biāo)記反應(yīng)制備TdT酶反應(yīng)液時(shí)，不添加TdT酶，其余步驟均相同。

四、標(biāo)記和顯色反應(yīng)：

操作注意事項(xiàng)：

1. 進(jìn)行PBS清洗時(shí)，以5分鐘清洗3次為標(biāo)準(zhǔn)。

2. PBS清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請(qǐng)盡量除去PBS溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)

3. 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。

4. TdT酶反應(yīng)液即用即配，短暫于冰上保存。不宜*保存，*保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活。

5.如果20×DAB溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。

6.蘇木素復(fù)染：將切片放入蘇木素染液，染色 30min ，蒸餾水沖洗干凈后放入鹽酸甲醇溶液中5s，立即用蒸餾水沖洗干凈。分別用70%、85%、95%、無(wú)水乙醇浸泡5分鐘。用二甲苯浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘。晾干后在切片上加中性樹(shù)膠，加蓋玻片。

現(xiàn)象	可能原因	建議
非特異性染色（例如：非凋亡細(xì)胞的強(qiáng)染色）	Biotin-dUTP的非特異性結(jié)合	勿使細(xì)胞干涸在TdT酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。
	TdT酶的濃度過(guò)高	用TdT dilution buffer* 作1：2—1：10稀釋
	內(nèi)源過(guò)氧化物酶未被封閉	封閉液室溫（15-25℃）封閉10min（封閉液： 3%H₂O₂溶于甲醇）
	光照紫外線(xiàn)導(dǎo)致包埋試劑的聚合（如：甲基丙烯酸會(huì)導(dǎo)致樣本DNA的斷裂）	嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑
	在固定組織時(shí)樣本DNA已斷裂（內(nèi)源核酸酶的作用）	確保樣品取樣后立即固定或通過(guò)肝靜脈灌注固定
	固定后某些核酸酶活性依然較高導(dǎo)致DNA斷裂	用含有dUTP和 dAPT的溶液封閉
染色背景較高	福爾馬林固定導(dǎo)致某些含黑色素前體的細(xì)胞染成黃色	嘗試以甲醇固定，但可能會(huì)降低檢測(cè)的敏感性。
	內(nèi)源過(guò)氧化物酶未被封閉	封閉液室溫（15-25℃）封閉10min（封閉液： 3%H₂O₂溶于甲醇）
	Biotin-dUTP的非特異性結(jié)合	在TdT酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml BSA 的PBS洗三次。
	樣本被支原體污染	使用支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，如陽(yáng)性則制備未被污染的新樣本
	標(biāo)記反應(yīng)試劑（TdT酶及dUTP）的濃度過(guò)高	稀釋50%，以降低標(biāo)記反應(yīng)的濃度
	細(xì)胞處于高度增殖期	在非高增殖期取樣檢測(cè)
	DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)	減少DAB染色時(shí)間
標(biāo)記率低、染色淡至無(wú)	如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標(biāo)記效率較低（因?yàn)樵诠潭〞r(shí)染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失）	用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定或福爾馬林或戊二醛固定。
	過(guò)度的固定導(dǎo)致與蛋白過(guò)度交聯(lián)	縮短固定時(shí)間，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定
	促滲條件不佳，以致于試劑不能到達(dá)靶分子或濃度過(guò)低	l 增加通透劑促滲時(shí)間 l 增加通透劑的作用溫度（15-25℃） l 優(yōu)化蛋白酶K的作用濃度和作用時(shí)間（如：以400ug/ml作用5min） l 0.1M的檸檬酸鈉70℃作用30min。

五 常見(jiàn)問(wèn)題的原因及*解決方案.

*TdT dilution buffer：60 mM KPB 緩沖液（pH7.2），150 mM KCl， 1 mM 2-mercaptoethanol， 50 % Glycerol

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