細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）
（JC-1 Apoptosis Detection Kit）
Cat number：KGA For Research Use Only
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Expire date：
一、試劑盒說(shuō)明
大量的研究表明線粒體與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其中線粒體跨膜電位（△y）的破壞，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中zui早發(fā)生的事件之一，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。
本試劑盒采用JC-1（5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide）一種陽(yáng)離子脂質(zhì)熒光染料作為檢測(cè)線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，在低濃度時(shí)以單體的形式存在，高濃度時(shí)以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同，但均可在流式細(xì)胞儀綠色（FL-1）通道檢測(cè)出綠色熒光，JC-1可透過(guò)正常細(xì)胞膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi)，正常健康線粒體的膜電位（△y）具有極性，JC-1依賴(lài)于△y的極性被迅速攝入線粒體內(nèi)，并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體，多聚體發(fā)射光為紅色熒光；可被流式細(xì)胞儀的紅色（FL-2）通道檢測(cè)到，而細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，紅光強(qiáng)度減弱，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。根椐這一特征檢測(cè)線粒體膜電位的變化。
本試劑盒可應(yīng)用于細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位檢測(cè)。
二、試劑盒組份
| 組份 | KGA601 （10 assays） | KGA602 （20 assays） | KGA603 （50 assays） | KGA604 100 assays） | 儲(chǔ)存條件 |
| JC-1 | 10μL | 20μL | 50μL | 100μL | 4℃避光 |
| 10×Incubation Buffer | 2.0 mL | 4.0 mL | 10 mL | 20 mL | 4℃ |
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡、高速離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、微量移液器
1.5m L Microtube、載玻片、蓋玻片（熒光顯微鏡觀察需用）、PBS、滅菌去離子水
四、使用注意事項(xiàng)
1． 微量試劑取用前請(qǐng)離心集液。
2． JC-1避光保存及使用。
3．細(xì)胞培養(yǎng)的數(shù)量不宜超過(guò)1×106，否則細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生自然凋亡影響檢測(cè)。
4．對(duì)PH變化過(guò)于敏感的細(xì)胞建議用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗滌，或延長(zhǎng)觀測(cè)時(shí)間
5．流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位變化受到多種因素的影響，因誘導(dǎo)劑、細(xì)胞株類(lèi)型，作用時(shí)間的不同而熒光強(qiáng)度比例都有不同，因此沒(méi)有通用標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)償設(shè)門(mén)指南，因此每個(gè)試驗(yàn)需設(shè)陰性及陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行熒光補(bǔ)償及設(shè)門(mén)。
6．組織需先制備單細(xì)胞懸液或提取純化線粒體后方可進(jìn)行檢測(cè)，可選用凱基細(xì)胞懸液制備試劑盒（KGA829）或線粒體提取試劑盒（KGA827）。
五、操作方法
1． 用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組【用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑（如星形孢菌素，staurosporine），誘導(dǎo)適當(dāng)時(shí)間后經(jīng)其它檢測(cè)（如AnnexinV或 Caspase 3活性）證實(shí)確有凋亡產(chǎn)生】，收集細(xì)胞；
2． 用PBS洗滌細(xì)胞二次（離心2000rpm，5min），收集不多于1×106的細(xì)胞；
3． 取100μL 10× Incubation Buffer加900μL滅菌去離子水稀釋成1× Incubation Buffer，混勻并預(yù)熱至37℃；
4． 吸取500μL 1× Incubation Buffer，加入1μL JC-1，渦旋混勻配成JC-1工作液；
【因JC-1在水中的溶解度很小，所以可以通過(guò)離心的方法（10，000rpm，1min）去除不溶的顆粒，吸取離心后的上清使用，以消除干擾】
5． 取500μL JC-1工作液將細(xì)胞均勻懸浮，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min；
6． 室溫離心（2000rpm，5min）收集細(xì)胞，用1× Incubation Buffer洗兩次；
7． 吸取500μL 1× Incubation Buffer重新懸浮細(xì)胞；
8． 熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀分析。
A． 熒光顯微鏡觀察
1． 滴一滴上述細(xì)胞懸液于載玻片，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察；
2． 對(duì)于貼壁細(xì)胞來(lái)說(shuō)，也可直接用蓋玻片來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；用PBS洗滌細(xì)胞兩次；
滴加100μL JC-1工作液，加蓋玻片，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min；1× Incubation Buffe洗滌1~2遍；將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察；
正常細(xì)胞：雙色濾光片觀察則為：綠++ 紅++（高綠高紅），如在同一濾光片下觀察則為黃綠色
凋亡細(xì)胞：雙色濾光片觀察則為：綠++ 紅+（高綠低紅），如在同一濾光片下觀察則為綠色
B． 流式細(xì)胞儀分析
用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（Ex=488 nm; Em=530 nm）細(xì)胞凋亡的情況，綠色熒光通過(guò)FITC通道通常為FL1來(lái)檢測(cè)；紅色熒光通過(guò)PI通道通常為FL2來(lái)檢測(cè)。.正常細(xì)胞{FL-1亮,FL-2亮; R1}，凋亡細(xì)胞 {FL-1亮, FL-2暗; R2}，設(shè)門(mén)的位置根椐細(xì)胞種類(lèi)、實(shí)驗(yàn)條件等不同而變化，試驗(yàn)需設(shè)未經(jīng)處理的正常細(xì)胞為陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，根椐陰性和陽(yáng)性對(duì)照組的雙參數(shù)散點(diǎn)圖來(lái)設(shè)定門(mén)的位置。
六、實(shí)驗(yàn)范例
用凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)P388細(xì)胞凋亡，在37oC，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~6h，利用凱基細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析分析結(jié)果如下。
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