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蛋白質(zhì)印跡分析（Western Blot Analysis）

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>
了解蛋白質(zhì)印跡法的基本原理及其操作和應(yīng)用。

【實(shí)驗(yàn)原理】
蛋白質(zhì)印跡法又稱(chēng)為免疫印跡法，這是一種可以檢測(cè)固定在固相載體上蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)技術(shù)方法。待測(cè)蛋白既可以是粗提物也可以經(jīng)過(guò)一定的分離和純化,另外這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用需要利用待測(cè)蛋白的單克隆或多克隆抗體進(jìn)行識(shí)別。
如圖所示，可溶性抗原，也就是待測(cè)蛋白首先要根據(jù)其性質(zhì)，如分子量，分子大小，電荷以及其等電點(diǎn)等采用不同的電泳方法進(jìn)行分離；通過(guò)電流將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗體（一抗）與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的原理，以抗體作為探針釣取目的蛋白。值得注意的是在加入一抗前應(yīng)首先加入非特異性蛋白，如牛血清白蛋白對(duì)膜進(jìn)行“封阻”而防止抗體與膜的非特異性結(jié)合。
經(jīng)電泳分離后的蛋白往往需再利用電泳方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上,我們把這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為電泳印跡。常用的兩種電轉(zhuǎn)移方法分別為:
1.半干法: 凝膠和固相載體被夾在用緩沖溶液浸濕的濾紙之間,通電時(shí)間為10分鐘~30分鐘。
2.濕法：凝膠和固相載體夾心浸放在轉(zhuǎn)移緩沖溶液中，轉(zhuǎn)移時(shí)間可從45分鐘延長(zhǎng)到過(guò)夜進(jìn)行。
由于濕法的使用彈性更大并且沒(méi)有明顯浪費(fèi)更多的時(shí)間和原料，因此我們?cè)谶@里只描述濕法的基本操作過(guò)程。
對(duì)于目的蛋白的識(shí)別需要采用能夠識(shí)別一抗的第二抗體。該抗體往往是購(gòu)買(mǎi)的成品，已經(jīng)被結(jié)合或標(biāo)記了特定的試劑，如辣根過(guò)氧化物酶。這種標(biāo)記是利用辣根過(guò)氧化物酶所催化的一個(gè)比色反應(yīng)，該反應(yīng)的產(chǎn)物有特定的顏色且固定在固相載體上，容易鑒別。因此可通過(guò)對(duì)二抗的識(shí)別而識(shí)別一抗，進(jìn)而判斷出目標(biāo)蛋白所在的位置。其他的識(shí)別系統(tǒng)包括堿性磷酸酶系統(tǒng)和¹²⁵I標(biāo)記系統(tǒng)。

【實(shí)驗(yàn)操作】

⒈.蛋白質(zhì)的分離

根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，利用電泳方法將其進(jìn)行分離。為提高電轉(zhuǎn)移的效率，通常采用SDS/PAGE技術(shù)。
分離實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，首先將樣品墻的上邊緣用小刀去除，然后在膠板的右上角切一個(gè)小口以便定位，小心放入轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。

⒉.電轉(zhuǎn)移

⑴ 準(zhǔn)備PVDF膜
根據(jù)膠的大小剪出一片PVDF膜，膜的大小應(yīng)略微小于膠的大小。將膜置于甲醇中浸泡1分鐘，再移至轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。


夾心放置順序
⑵ 制作膠膜夾心
在一淺盤(pán)中打開(kāi)轉(zhuǎn)移盒，將一個(gè)預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸泡過(guò)的海綿墊放在轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板上，在海綿墊的上方放置經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕的3MM紙，小心地將膠板放在3MM紙上，并注意排除氣泡。將PVDF膜放在膠的上方同時(shí)注意排除氣泡，再在膜的上方放上一張同樣用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕過(guò)的3MM紙并趕出氣泡，放置另一張浸泡過(guò)的海綿墊，關(guān)閉轉(zhuǎn)移盒。將轉(zhuǎn)移盒按照正確的方向放入轉(zhuǎn)移槽中，轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的黑色端，轉(zhuǎn)移盒的白色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的白色端，填滿(mǎn)轉(zhuǎn)移緩沖溶液同時(shí)防止出現(xiàn)氣泡。
⑶ 電轉(zhuǎn)移
連接電源,在4°C條件下維持恒壓100v，1小時(shí)
⒊.免疫檢測(cè)
⑴ 膜染色
斷開(kāi)電源，將轉(zhuǎn)移盒從轉(zhuǎn)移槽中移出，將轉(zhuǎn)移盒的各個(gè)部分分開(kāi)。用鑷子將PVDF膜小心放入一個(gè)干凈的容器中，用TBS緩沖溶液進(jìn)行短暫清洗，從膜上剪下一條寬約5mm的膜放入另一個(gè)干凈的容器中。將這條膜在染色液中浸泡1分鐘，然后在脫色液中脫色30分鐘,確定蛋白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。
⑵ 膜的封閉和清洗
對(duì)于沒(méi)有進(jìn)行染色的膜，首先倒出TBS緩沖溶液,加入3%封閉緩沖溶液,輕輕搖動(dòng)至少1小時(shí)。倒掉3%封閉緩沖溶液，并用TBS緩沖溶液清洗3次, 每次5分鐘。
⑶ 一抗
倒掉TBS緩沖溶液，加入10 ml 0.5%封閉緩沖溶液及適量的一抗，輕輕搖動(dòng)1小時(shí)以上。從容器中倒出一抗及封閉緩沖溶液，用TTBS緩沖溶液清洗兩次，每次10分鐘。
⑷ 二抗
倒出TTBS 緩沖溶液，加入5 ml 0.5%封閉緩沖溶液及適量的二抗。輕輕搖動(dòng)30分鐘，倒出二抗及封閉緩沖溶液，用TTBS緩沖溶液清洗兩次，每次10分鐘。
⑸ 檢測(cè)
倒掉TTBS 緩沖溶液，并加入顯影劑，輕輕搖動(dòng)PVDF膜，觀察顯影情況，當(dāng)能夠清晰的看到顯色帶時(shí)，用蒸餾水在30分鐘內(nèi)分三次清洗PVDF膜以終止顯色反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行。
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
檢查膜上顯色結(jié)果，藍(lán)紫色帶所對(duì)應(yīng)的即是目標(biāo)蛋白的位置。

實(shí)驗(yàn)材料】

1. 實(shí)驗(yàn)器材

SDS/PAGE實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料；電轉(zhuǎn)移裝置；供電設(shè)備；PVDF膜（Millipore Immobion-P #IPVH 000 10）；Whatman 3MM 紙；其他工具：鑷子、海綿墊、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、淺盤(pán)。

⑴ 10x轉(zhuǎn)移緩沖溶液（1L）：30.3g Trizma base（0.25M）, 144 g甘氨酸（1.92M）,加蒸餾水至1L, 此時(shí)pH約為8.3，不必調(diào)整。

⑵ 1x轉(zhuǎn)移緩沖溶液（2L）：在1.4L蒸餾水中加入400 ml甲醇及200 ml10x 轉(zhuǎn)移緩沖溶液。

⑶ TBS 緩沖溶液:將1.22g Tris （10 mM）和8.78g NaCl（150 mM）加入到1L蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.5。

⑷ TTBS buffer：在1L TBS 緩沖溶液中加入0.5ml Tween 20（0.05%）。

⑸ 一抗：兔抗待測(cè)蛋白抗體（多克隆抗體）。

（6） 二抗：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔。

⑺ 3% 封阻緩沖溶液（0.5L）：牛血清白蛋白15mg加入TBS緩沖溶液并定容至0.5L，過(guò)濾，在4°C 保存以防止細(xì)菌污染。

⑻ 0.5%封阻緩沖溶液（0.5L）：牛血清白蛋白2.5mg加入TTBS緩沖溶液并定容至0.5L，過(guò)濾，在4°C 保存以防止細(xì)菌污染。

⑼ 顯影試劑：1ml 氯萘溶液 （30mg/ml甲醇配置），加入10 ml甲醇，加入TBS緩沖溶液至50 ml，加入30 ul 30% H₂O₂。

⑽ 染色液：1g氨基黑18B （0.1%），250ml異丙醇（25%）及100ml乙酸（10%）用蒸餾水定容至1L。

⑾ 脫色液：將350ml異丙醇（35%）和20 ml乙酸（2%）用蒸餾水定容至1L。