類器官（Organoid）是十四五國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃中6個(gè)重點(diǎn)專項(xiàng)之一，是國(guó)家科技部的重點(diǎn)關(guān)注項(xiàng)目。近年來(lái)相關(guān)的項(xiàng)目和文章也迅速升溫，僅過(guò)去的2023年上半年，“Organoid"相關(guān)文章就有兩千多篇，遠(yuǎn)超前幾年同期水平，意味著該領(lǐng)域的研究熱度持續(xù)上升。
國(guó)自然基金申報(bào) “內(nèi)卷"趨勢(shì)越來(lái)越顯著，而類器官（Organoid）作為前沿?zé)狳c(diǎn)技術(shù)之一，近年來(lái)備受申請(qǐng)人和評(píng)審專家們的關(guān)注。類器官相關(guān)的課題和項(xiàng)目在申請(qǐng)國(guó)自然上具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。尤其是2018年以來(lái)，類器官相關(guān)方向，連續(xù)幾年被國(guó)自然申報(bào)指南列為推薦項(xiàng)目的研究方向。作為具有高適用度的體外模型之一，類器官?gòu)淖畛醯捏w外模型補(bǔ)充參考的工具，逐漸開(kāi)始“挑國(guó)自然大梁"。
PubMed類器官相關(guān)文章數(shù)量趨勢(shì)
近期，一篇以《人腦類器官中的譜系記錄》（Lineage recording in human cerebral organoids）為題的類器官文獻(xiàn)登上Nature Methods。該文獻(xiàn)結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組以及4D光片顯微成像技術(shù)（長(zhǎng)時(shí)間高分辨類器官光片顯微鏡），實(shí)現(xiàn)了人類大腦類器官的譜系記錄。
近年來(lái)，人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSCs衍生的類器官，為研究人體器官發(fā)育提供了模型。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠高度鑒定系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)的描述，然而，目前還沒(méi)有很好的方法直接測(cè)量細(xì)胞譜系關(guān)系。譜系偶聯(lián)scRNA-seq允許在復(fù)雜組織和其他細(xì)胞分化場(chǎng)景中更好地注釋細(xì)胞命運(yùn)規(guī)范和軌跡推斷。長(zhǎng)時(shí)間高分辨類器官光片顯微鏡基于圖像的方法，為捕捉全面的發(fā)育動(dòng)態(tài)提供了一種可視化方法。因此，譜系偶聯(lián)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和長(zhǎng)時(shí)間高分辨類器官光片顯微鏡為記錄和理解iPSCs建立的類器官系統(tǒng)的譜系動(dòng)力學(xué)提供了全面的解決方案。
長(zhǎng)時(shí)間高分辨類器官光片顯微鏡-LS2是一款全新光片成像平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間、高分辨、高通量、多樣品同時(shí)成像，非常適合對(duì)直徑達(dá)300 μm的光敏樣品（如卵母細(xì)胞，胚胎和類器官）進(jìn)行長(zhǎng)期實(shí)時(shí)高時(shí)空分辨率和低光毒性的觀察與成像。這一成熟的長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)類器官成像技術(shù)也為本實(shí)驗(yàn)提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)支撐。
作者建立了一個(gè)雙通道細(xì)胞譜系記錄系統(tǒng)(iTracer) 來(lái)了解腦類器官腦區(qū)域化過(guò)程中的譜系動(dòng)力學(xué)。系統(tǒng)設(shè)置從最原始的iPSCs樣本庫(kù)中開(kāi)始跟蹤克隆，同時(shí)也允許使用誘導(dǎo)疤痕在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行譜系記錄，以解決動(dòng)力學(xué)與神經(jīng)元命運(yùn)之間建立關(guān)系尚不明確的問(wèn)題。該系統(tǒng)既可以進(jìn)行克隆分析，也可以探索細(xì)胞命運(yùn)建立的時(shí)間動(dòng)態(tài)，避免了多輪標(biāo)記。在腦類器官發(fā)育的時(shí)間過(guò)程中進(jìn)行的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析證實(shí)，在單個(gè)類器官中形成了不同的腦區(qū)域，類器官中的腦區(qū)域特征與發(fā)育中的小鼠大腦空間原位地圖集的對(duì)應(yīng)區(qū)域非常相似。使用iTracer來(lái)探索在腦類器官模式和神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中與分子特征相結(jié)合的譜系，并表明該系統(tǒng)與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)兼容。
圖1 iTracer Sleeping Beauty示意圖并且揭示了人類大腦類器官細(xì)胞命運(yùn)的克隆性
為了將分子狀態(tài)、細(xì)胞譜系和位置信息聯(lián)系起來(lái)，作者建立了“空間iTracer"，它使用空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)來(lái)測(cè)量基因表達(dá)和iTracer讀取結(jié)果。數(shù)據(jù)表明，在腦類器官發(fā)育過(guò)程中，相關(guān)細(xì)胞傾向于聚集在類器官的同一區(qū)域，接收相似的圖案信號(hào)，因此平均而言被限制在相同的大腦區(qū)域身份中。iTracer和空間iTracer共同揭示了腦類器官不同腦區(qū)細(xì)胞克隆的富集，這可以追溯到初始化EB 內(nèi)的克隆。
圖2 空間iTracer連接腦類器官的譜系、分子狀態(tài)和位置信息
為了直接測(cè)量神經(jīng)外胚層到神經(jīng)上皮階段發(fā)育中的類器官的譜系動(dòng)力學(xué)和克隆的空間積累，作者使用4D光片顯微成像技術(shù)（長(zhǎng)時(shí)間高分辨類器官光片顯微鏡）建立了發(fā)育中的腦類器官的長(zhǎng)期實(shí)時(shí)成像(圖3a)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，作者生成了含有5% iPSCs的類器官，其細(xì)胞核被FUS-mEGFP熒光報(bào)告標(biāo)記，將EB嵌入成像室的Matrigel中，并在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，類器官使用Viventis Microscopy開(kāi)發(fā)的LS1 Live光片顯微鏡成像，使用X25物鏡，每2 μm獲得連續(xù)z步，共150步。采集幀率為30分鐘，總共100小時(shí)(200幀)用于跟蹤。并跟蹤發(fā)育 65-100小時(shí)(圖3b)。隨著EB的生長(zhǎng)和發(fā)育，觀察到幾個(gè)管腔的形成，每個(gè)管腔都可以在三維上跟蹤(圖3c)。
圖3 腦類器官發(fā)育的長(zhǎng)時(shí)間高分辨類器官光片顯微鏡4D成像
在整個(gè)記錄時(shí)間內(nèi)，作者使用Mastodon直接跟蹤單個(gè)細(xì)胞核的譜系，這是一個(gè)允許在大型4D數(shù)據(jù)集中半自動(dòng)跟蹤和管理細(xì)胞核譜系的方案(圖3d,e)。他可視化了源自原始細(xì)胞核的子細(xì)胞的空間分布，稱之為譜系1 (L1)，并生成了100小時(shí)增殖后的譜系樹(shù)(圖3f)。一個(gè)細(xì)胞周期的平均持續(xù)時(shí)間估計(jì)為17.3小時(shí)。作者觀察到，在整個(gè)記錄時(shí)間內(nèi)，L1仍然局限于腔內(nèi)的同一區(qū)域(圖3d)。跟蹤了另外三個(gè)核，其中兩個(gè)核與L1 (L2-L3)在相同的管腔區(qū)域相鄰，第三個(gè)核(L4)位于EB中一個(gè)截然相反的未來(lái)管腔區(qū)域(圖3g)。作者量化了每個(gè)樹(shù)之間的空間距離，并檢查了類器官3D空間內(nèi)所有子細(xì)胞的分布(圖3g-i)。在65小時(shí)的過(guò)程中，初始化細(xì)胞核平均產(chǎn)生13個(gè)后代細(xì)胞核，它們都填充在擴(kuò)大的類器官中，但在空間上仍然局限于親本管腔，表現(xiàn)出有限的遠(yuǎn)離其譜系成員的遷移(圖3g-i)。這些結(jié)果表明，克隆的早期空間排列隨后的局部擴(kuò)增導(dǎo)致腦區(qū)域的不同譜系組成，這證實(shí)了之前基于iTracer的類器官腦區(qū)域克隆性觀察(圖3j)。
腦類器官發(fā)育的長(zhǎng)時(shí)間高分辨類器官光片成像視頻
另外，作者還使用iTracer來(lái)確定細(xì)胞在腦類器官發(fā)育過(guò)程中何時(shí)限制了它們的命運(yùn)。研究者使用譜系記錄器的兩個(gè)通道(在EB初始化和發(fā)育過(guò)程中誘導(dǎo)的疤痕中引入的條形碼)以及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組來(lái)構(gòu)建命運(yùn)映射的全類器官系統(tǒng)發(fā)育。使用iTracer以高分辨率評(píng)估不同腦類器官區(qū)域中祖細(xì)胞到神經(jīng)元譜系的可變性。為了實(shí)現(xiàn)深層譜系采樣，他們對(duì)200 μm iTracer類器官切片的兩個(gè)微解剖外周區(qū)域進(jìn)行了譜系偶聯(lián)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)。
作者整合了靜態(tài)序列標(biāo)記和基于CRISPR 技術(shù)的動(dòng)態(tài)序列標(biāo)記，可用于標(biāo)記起始時(shí)間點(diǎn)的不同干細(xì)胞，也包括基于 CRISPR 編輯系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)序列標(biāo)記，結(jié)合帶有可誘導(dǎo) Cas9 蛋白基因的干細(xì)胞，即可在特定時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生額外的隨機(jī)突變，從而得到第二層細(xì)胞譜系信息。通過(guò)使用4D光片顯微成像技術(shù)（長(zhǎng)時(shí)間高分辨類器官光片顯微鏡），對(duì)稀疏核標(biāo)記的大腦類器官進(jìn)行追蹤觀察。而在此基礎(chǔ)上，通過(guò)在不同時(shí)間點(diǎn)引入動(dòng)態(tài)序列標(biāo)記，還可得到大腦類器官中不同細(xì)胞類型、特別是不同類型神經(jīng)元的命運(yùn)決定關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，并對(duì)同一多能干細(xì)胞產(chǎn)生的不同后代神經(jīng)元的分化情況進(jìn)行比較。進(jìn)而得出在分裂分化過(guò)程中，大腦類器官的細(xì)胞并未發(fā)生顯著的細(xì)胞遷移，因而其后代細(xì)胞呈聚集分布，并在類似的微環(huán)境作用下，被誘導(dǎo)為同樣類型的神經(jīng)元。
未來(lái)，iTracer以及4D光片顯微成像技術(shù)（長(zhǎng)時(shí)間高分辨類器官光片顯微鏡）的聯(lián)合應(yīng)用將成為了解人類類器官系統(tǒng)發(fā)育障礙背后的突變影響的有力方法。
參考文獻(xiàn)：
[1]. He et al., Lineage recording in human cerebral organoids. Nature Methods
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