傳統(tǒng)高壓透射電子顯微鏡 (TEM) 的樣品制備通常使用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛等重金屬元素染色劑。然而，由于醋酸雙氧鈾的高毒性、日益嚴(yán)格的法律法規(guī)以及復(fù)雜的廢物處理問題，科研工作者開始逐步減少使用這種染色劑并探究更加無害便捷的生物樣品透射成像工具。
為了研究不同成像和染色策略對生物樣品透射成像的影響，捷克科學(xué)院的Vladislav Krzyzanek團隊與Delong公司合作，使用無需負(fù)染的LVEM25低電壓生物型透射電子顯微鏡及傳統(tǒng)200kV透射電子顯微鏡分別觀察未染色的及用檸檬酸鉛、醋酸雙氧鈾染色的藍(lán)藻切片樣品。所得結(jié)果以Urany-Less Low Voltage Transmission Electron Microscopy: A Powerful Tool for Ultrastructural Studying of Cyanobacterial Cells 發(fā)表在Microorganisms 上。
該研究團隊制備了用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛負(fù)染的藍(lán)藻細(xì)胞切片以及無負(fù)染的藍(lán)藻細(xì)胞切片（切片厚度75nm），使用傳統(tǒng)的200kV透射電鏡與LVEM25生物型透射電子顯微鏡對這些樣品進(jìn)行了觀察。如下圖所示，圖A中傳統(tǒng)透射電鏡下的細(xì)胞切片幾乎無法觀察細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，圖B和圖C可以清楚地觀察到藍(lán)藻的內(nèi)部囊泡結(jié)構(gòu)。
圖1. (A) 200 kV加速電壓，無染色藍(lán)藻細(xì)胞切片，(B) 200 kV加速電壓，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色藍(lán)藻細(xì)胞切片，(C) 25 kV加速電壓（LVEM25），無染色藍(lán)藻細(xì)胞切片，(D) 25 kV加速電壓（LVEM25）并用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色藍(lán)藻細(xì)胞切片。 標(biāo)尺：1 µm。
通過下圖可以觀察到，使用200kV電鏡觀察醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛負(fù)染的樣品（左圖）與25kV電鏡觀察非負(fù)染的樣品（右圖），均可清晰的觀察藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)的類囊體（箭頭所指）、羥基體（三角形標(biāo)記）、糖原顆粒（gg標(biāo)記）等細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)。同時25kV觀察的非負(fù)染樣品表面由染色液造成的“噪聲"更低，超薄切片機刀片切割的痕跡都清晰可見，核糖體等顆粒的襯度（黑白對比度）更高。
圖2. 使用不同成像條件獲取藍(lán)藻細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。
(A) 使用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色的樣品，使用 200 kV 電鏡成像；(B) 未染色的樣品，使用 25 kV（LVEM25）成像。箭頭標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)：類囊體膜； 箭頭：PHA顆粒； 三角形：羧基體； 十字：沖掉的顆粒； gg：糖原顆粒。 標(biāo)尺：500 nm。
此外，為了檢查減少色差的可能性（色差在使用較低能量的電子成像時通常會引起問題），還使用掃描透射電子顯微鏡（STEM）在 15 kV 加速電壓下對樣品進(jìn)行了成像。 如下圖所示，使用重金屬負(fù)染液可能殘留沉淀的重金屬染液雜質(zhì)，這些質(zhì)密的雜質(zhì)會在成像過程中留下“偽影"，導(dǎo)致觀察者無法準(zhǔn)確判斷生物樣品的結(jié)構(gòu)特征。
圖3. LVEM25生物型透射電鏡的STEM模式在 15 kV 加速電壓電子束藍(lán)藻細(xì)胞進(jìn)行成像。
A：未染色的樣品，B:使用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色的樣品。 雜質(zhì)用箭頭標(biāo)記。標(biāo)尺：1 µm
LVEM25兼具STEM成像模式，15kV的STEM 提供了藍(lán)藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的清晰圖像，具有令人滿意的對比度且15kV的STEM對負(fù)染樣品成像的對比度更佳（見下圖B/D）。
圖4.使用LVEM25在不同成像模式下獲得的藍(lán)藻細(xì)胞圖像的比較。
（A）使用 LVEM25在 TEM 模式下成像的未染色樣品，(B) 使用 LVEM25在 TEM 模式下成像的乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛負(fù)染樣品，(C) 使用 LVEM25在 STEM 模式(15kV)下成像的未染色樣品，(D) 使用 LVEM25在 STEM 模式(15kV)下成像的乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色樣品。 標(biāo)尺：1 µ
綜上所述，傳統(tǒng)的200kV透射電鏡負(fù)染成像與LVEM25非負(fù)染成像都為我們提供了有關(guān)藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)圖片。而使用LVEM25成像的未染色樣品在檢測到的圖像中顯示出超小的“噪聲"。而且與傳統(tǒng)染色相比，細(xì)胞內(nèi)的糖原顆粒也更清晰可辨。傳統(tǒng)染色成像樣品圖像中的由染色液沉淀造成的“噪聲"與“偽影"更加明顯，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)原本存在的質(zhì)密顆粒（如糖原）被誤認(rèn)為是染液的污染，LVEM25則擺脫了這些傳統(tǒng)重金屬負(fù)染液帶來的成像問題。同時LVEM25兼具的STEM成像模式也可以對生物樣品取得良好的成像效果。
上述研究使用的LVEM25生物型透射電子顯微鏡，采用了25kV的低加速電壓設(shè)計，一次性地擺脫了上述所有的成像難題，LVEM25還可以對病毒、細(xì)菌、脂質(zhì)體、外泌體等生物樣品無負(fù)染直接成像，為生物樣品的電鏡成像提供尤為便捷高效的解決方案。
圖5. LVEM25成像實例 A：腺相關(guān)病毒 B：擬菌病毒 C：脂質(zhì)體 D：成纖維細(xì)胞與細(xì)菌
傳統(tǒng)高壓透射電鏡本身就會帶來樣品細(xì)節(jié)損失，在80-120kV下的透射電鏡成像過程中，大量十幾納米尺寸的顆粒會直接被“擊穿"。而LVEM25生物型透射電鏡采用的25kV低電壓設(shè)計，不僅避免了傳統(tǒng)高壓透射電鏡長時間照射對于生物樣品、有機納米顆粒的損害，還可以保留下更多地小有機顆粒圖像，獲得更多地細(xì)節(jié)。
圖6. 有機納米顆粒成像 左：80kV條件下成像 右：LVEM25成像
LVEM25生物型透射電子顯微鏡技術(shù)特點：
高襯度：低能量電子對有機分子產(chǎn)生更強烈的散射，具有更高對比度。
無需染色：突破以往生物/輕材料成像需要重金屬染色的局限性。
高分辨率：無染色條件下能夠達(dá)到1.0 nm的圖像分辨率。
多模式：LVEM25能夠在TEM、STEM模式中自由切換。
高效方便：真空準(zhǔn)備只需要3分鐘，空間小，環(huán)境需求低。
易操作且成本低：友好智能化操作界面，低耗材，低維護費用，無需專業(yè)操作人員。
LVEM25生物型透射電子顯微鏡
參考文獻(xiàn)：
[1]. Mrazova K, Bacovsky J, Sedrlova Z, et al. Urany-Less Low Voltage Transmission Electron Microscopy: A Powerful Tool for Ultrastructural Studying of Cyanobacterial Cells[J]. Microorganisms, 2023, 11(4): 888.
相關(guān)產(chǎn)品：
1、低電壓臺式透射電子顯微鏡-LVEM5 
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