拉曼光譜技術(shù)

近年來(lái)，拉曼光譜和成像技術(shù), 得益于其相對(duì)于紅外光譜技術(shù)異的空間分辨率等勢(shì)，在研究樣品的分子振動(dòng)方向得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是生物樣品，因?yàn)樗械睦庾V背景信號(hào)更弱。相干拉曼散射顯微技術(shù)（Coherent Raman scattering microscopy）近些年也得到了大力的發(fā)展，其基于相干反斯托克斯拉曼散射（coherent anti-Stokes Raman scattering）或受激拉曼散射（stimulated Raman scattering），大大改善拉曼的成像速度。例如，蛋白質(zhì)和脂肪在皮膚內(nèi)的分布情況，可以通過(guò)兩者在C-H伸縮振動(dòng)區(qū)征的拉曼譜帶進(jìn)行視頻的高速成像來(lái)獲得。

然而拉曼光譜和成像技術(shù)也存在著自身的些不足：

（1）較低的拉曼散射截面，尤其是在指紋區(qū)，相對(duì)于紅外技術(shù)弱5-10倍；

（2）會(huì)受到熒光的干擾，由于拉曼信號(hào)偏弱，些樣品的熒光信號(hào)又寬又強(qiáng)，會(huì)定程度上覆蓋拉曼信號(hào)；

光學(xué)光熱紅外技術(shù)

基于光學(xué)-光熱紅外技術(shù)(O-PTIR)的亞微米分辨率紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)mIRage，使用寬可調(diào)諧的脈沖紅外激光源激發(fā)樣品，在樣品中產(chǎn)生調(diào)制光熱效應(yīng)。通過(guò)光熱效應(yīng)提取并計(jì)算紅外吸收, 通過(guò)檢測(cè)反射探頭光束強(qiáng)度的變化作為紅外波數(shù)調(diào)諧的函數(shù)，從而提供紅外吸收光譜。這種短波長(zhǎng)脈沖探測(cè)光束(通常是532 nm)決定了紅外測(cè)試空間分辨率，而不是傳統(tǒng)FTIR/QCL顯微鏡中依賴的紅外波長(zhǎng)。由于其*的系統(tǒng)架構(gòu)，短波長(zhǎng)探測(cè)光束同樣也能作為個(gè)拉曼激光源，當(dāng)集成拉曼光譜儀，mIRage系統(tǒng)可以提供同地點(diǎn)，同時(shí)間，同空間分辨率的亞微米紅外+拉曼顯微鏡的檢測(cè)結(jié)果。

mIRage光譜的顯著勢(shì)：

1. 和拉曼光譜致的亞微米空間分辨率，比傳統(tǒng)FTIR/QCL顯微鏡提高30倍，達(dá)到500 nm；

2. 非接觸式測(cè)量，非破壞性，反射(遠(yuǎn)場(chǎng))模式測(cè)量，無(wú)須復(fù)雜的樣品制備；

3. 高質(zhì)量光譜(測(cè)試可兼容粒子形狀/尺寸和表面粗糙度)，沒(méi)有色散/散射偽影問(wèn)題；

4. 可直接在商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配搜索

5. 可實(shí)現(xiàn)紅外和拉曼光譜成像同步測(cè)量

單細(xì)胞光譜與成像——拉曼光譜技術(shù) vs.光學(xué)光熱紅外技術(shù)

如上文所述，拉曼散射的橫截面在指紋區(qū)相對(duì)于紅外弱五到十倍，即相比于拉曼散射,紅外吸收在指紋區(qū)域比在高波數(shù)C─H和O─H拉伸區(qū)有更大的橫截面。以PMMA為例，C-H振動(dòng)模式在3.39 μm的線性吸收系數(shù)為1396 cm^?1，而在指紋區(qū)域，C=O拉伸振動(dòng)模式在5.78 μm的線性吸收系數(shù)可達(dá)到7904 cm^?1，約高6倍。PMMA的紅外光譜和拉曼光譜的直接對(duì)比如下所示。指紋區(qū)域較大的紅外吸收截面可以允許mIRage顯微鏡對(duì)單病毒進(jìn)行振動(dòng)光譜的檢測(cè)分析，而這對(duì)拉曼或相關(guān)拉曼光譜來(lái)說(shuō)十分困難。在相同的激光功率和采集時(shí)間下，mIRage中紅外顯微鏡比拉曼光譜具有更高的信噪比，進(jìn)步可以用于檢測(cè)細(xì)菌對(duì)抗生素紅霉素等藥物的反應(yīng)。綜上所述，兩種振動(dòng)光譜技術(shù)并沒(méi)有相互競(jìng)爭(zhēng)，而是提供了互補(bǔ)的信息，現(xiàn)在越來(lái)越多的趨勢(shì)傾向于同時(shí)獲取拉曼光譜和紅外光譜來(lái)全面研究樣品的分子振動(dòng)信息。

參考文獻(xiàn)：

Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect，Sci. Adv. 2021; 7 : eabg1559.

具體案例：

1. 同位素標(biāo)記的大腸桿菌單細(xì)菌細(xì)胞的mIRage顯微紅外譜圖與成像

近期，英國(guó)物浦大學(xué)Roy Goodacre教授分享了關(guān)于同位素標(biāo)記的細(xì)菌的振動(dòng)光譜研究成果。該研究借助于單細(xì)胞亞微米分辨率紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)mIRage，通過(guò)紅外光譜和成像分析，來(lái)揭示細(xì)菌代謝的過(guò)程和機(jī)理，不僅包含細(xì)菌群落，還包含微生物之間的相互作用。由于傳統(tǒng)顯微紅外光譜儀的空間分辨率較低，目前多數(shù)研究都集中在細(xì)胞群落的評(píng)估上，而該研究作為個(gè)重大的突破，次使用亞微米光熱紅外光譜技術(shù)在單細(xì)胞水平上評(píng)估細(xì)菌對(duì)標(biāo)記化合物的吞并行為過(guò)程。

參考文獻(xiàn)：

Imaging Isotopically Labeled Bacteria at the Single-Cell Level Using High-Resolution Optical Infrared Photothermal Spectroscopy，Anal. Chem. 2021, 93, 6，3082-3088.

2. mIRage顯微紅外譜與Raman光譜協(xié)同分析固定或活的單細(xì)胞

英國(guó)曼徹斯大學(xué)的Peter Gardner教授近期發(fā)表了他們關(guān)于活(和固定)細(xì)胞振動(dòng)光譜分析的新研究結(jié)果。他們使用亞微米分辨的mIRage紅外光譜及拉曼顯微鏡，并借助于兩個(gè)激發(fā)源（QCL和OPO激光器），對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了寬光譜范圍的覆蓋，從而使所有與生物學(xué)相關(guān)的分子振動(dòng)都能被檢測(cè)到，且保持致的亞微米的空間分辨率。此外，紅外光譜采集與拉曼光譜有效的結(jié)合起來(lái)，在相同的激發(fā)位置，形成振動(dòng)互補(bǔ)，得到套完整的振動(dòng)光譜信息。如下圖所示，該紅外和拉曼的組合方式可以用來(lái)分析液體環(huán)境中固定或活細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中的蛋白質(zhì)二次結(jié)構(gòu)及富脂體均可以在亞微米尺度上被有效地識(shí)別出來(lái)。

參考文獻(xiàn)：

Analysis of Fixed and Live Single Cells Using Optical Photothermal Infrared with Concomitant Raman Spectroscopy，Anal. Chem. 2021, 93, 8, 3938–3950.

3. 亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)mIRage用于微塑料鑒定等相關(guān)域

美國(guó)拉華大學(xué)Isao Noda教授課題組與Photothermal Spectroscopy Corp公司合作，用基于光學(xué)光熱紅外技術(shù)的新代非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)mIRage對(duì)聚乳酸(PLA)和聚羥基烷酸酯(PHA)的復(fù)合薄片進(jìn)行紅外拉曼同步成像分析，探究這兩種材料結(jié)合的方式和內(nèi)在機(jī)理。為探求界面處PHA/PLA組分的空間分布規(guī)律，同步和異步二維相關(guān)光譜(2D-COS，two-dimensional correlation spectroscopy)被用來(lái)分析羰基拉伸區(qū)域采集到的紅外譜圖。結(jié)果顯示，在主要為PHA的混合界面區(qū)域同時(shí)觀測(cè)到來(lái)源于PLA的1760 cm^-1紅峰外，表明部分PLA滲透到PHA層，且與PHA層的其余部分相比，界面附近的PHA結(jié)晶度明顯降低。另外，作者還通過(guò)mIRage對(duì)該區(qū)域進(jìn)行了同步紅外和拉曼分析，兩者選擇性和靈敏度不同卻可以很好的互補(bǔ)，進(jìn)步驗(yàn)證了這發(fā)現(xiàn)的可靠性。結(jié)果證實(shí)，即使是表面上不混相的PHA和PLA聚合物對(duì)，也存在定程度的分子混合，這種混合可能發(fā)生在界面只有幾百納米的空間水平上，很好的解釋了這兩種生物塑料之間的高度相容性。

參考文獻(xiàn)：

Two-dimensional correlation analysis of highly spatially resolved simultaneous IR and Raman spectral imaging of bioplastics composite using optical photothermal Infrared and Raman spectroscopy，Journal of Molecular Structure， DOI: 10.1016/j.molstruc.2020.128045.

總結(jié)

亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)mIRage作為種新型的紅外光譜技術(shù)，具有傳統(tǒng)FTIR顯微鏡不可比擬的點(diǎn)，并克服了許多限制。，mIRage可以提供空間分辨率約為500 nm的紅外譜圖，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了典型的紅外衍射限空間分辨率，且不依賴于入射紅外波長(zhǎng)。更重要的是，它能夠以反射/非接觸(遠(yuǎn)場(chǎng))工作模式簡(jiǎn)單快速的生成高質(zhì)量的類(lèi)似于FTIR的譜圖，從而避免了制備樣本薄切片的必要，且光譜與商用FTIR數(shù)據(jù)庫(kù)搜索*兼容和可譯。另外，即使樣品中包含易產(chǎn)生熒光干擾的組分（壓制拉曼信號(hào)或造成其飽和），mIRage的可調(diào)制信號(hào)收集性也確保它*不受任何熒光的影響。IR和Raman在mIRage方法的結(jié)合下，可以充分用這兩種互補(bǔ)性技術(shù)的勢(shì)，實(shí)現(xiàn)同步的紅外吸收和拉曼散射測(cè)量，并相互印證。

相關(guān)產(chǎn)品：
非接觸亞微米分辨紅外拉曼同步測(cè)量系統(tǒng)