目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC5265-100T/48S丙酮酸含量檢測試劑盒 微量法
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T/48S |
| 貨號 | BC5265 | 應用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)業(yè),綜合 |
| 主要用途 | 丙酮酸含量檢測 |
丙酮酸（PA）含量檢測試劑盒（酶法）說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC5265
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體25mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體13μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體4 mL×1瓶 | |
標準品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加入1.2mL蒸餾水充分溶解，分裝保存，-20℃可以保存4周，避免反復凍融；
2、 試劑三：臨用前按試劑三：蒸餾水=1μL：100μL（約6T）的比例進行稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。
3、 標準品：20 μmol/mL丙酮酸鈉標準液。
產(chǎn)品說明：
丙酮酸通過乙酰 CoA 連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。
在pH = 7.5 時，丙酮酸在LDH的催化作用下與NADH反應，生成NAD + 和乳酸。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應，產(chǎn)生水溶性formazan。通過檢測450nm條件下吸光值，可以計算出丙酮酸含量。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（106個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 200w，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
3. 血清（漿）等其他液體：直接檢測。若有沉淀請離心后取上清待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到450nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。
2、 試劑一37℃預熱20min。
3、 標準品的制備：將20μmol/mL丙酮酸鈉標準液用蒸餾水稀釋得到1、0.625、0.5、0.3125、0.25、0.15625μmol/mL標準溶液備用。
4、 標準品稀釋表：
序號 | 稀釋前濃度（μmol/mL） | 標準液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度μmol/mL） |
1 | 20 | 50 | 950 | 1 |
2 | 1 | 625 | 375 | 0.625 |
3 | 0.625 | 800 | 200 | 0.5 |
4 | 0.5 | 625 | 375 | 0.3125 |
5 | 0.3125 | 800 | 200 | 0.25 |
6 | 0.25 | 625 | 375 | 0.15625 |
實驗中每個標準管需20µL標準溶液。
5、 操作表：（在1.5mL EP管中依次加入下列試劑）
三、丙酮酸含量計算
1、標準曲線繪制：
根據(jù)標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據(jù)標準曲線，將ΔA測定代入方程得到x（μmol/mL）。
2、丙酮酸含量計算：
（1）按液體樣本的體積計算
丙酮酸含量（μmol/mL）=x×V樣÷V樣= x
（2）按組織質(zhì)量計算
丙酮酸含量（μmol/g 質(zhì)量）= x×V樣÷(V樣÷V提×W) = x÷W
（3）按蛋白濃度計算
丙酮酸含量（μmol/mg prot）= x×V樣÷（Cpr×V樣）= x÷Cpr
（4）按細菌/細胞數(shù)量計算
丙酮酸含量（μmol/106 cell）= x ×V樣÷（V樣÷V提×N）= x÷N
V樣：加入的樣本體積，0.02mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；V提：加入提取液的體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細菌或細胞數(shù)量，以百萬計。
注意事項：
1. 如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用蒸餾水稀釋樣本后再進行測定。
實驗實例：
1、 稱取約0.1g鼠肺，加入1mL提取液，冰浴研磨，8000g，4℃離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定=（A空白1- A空白2）-（A測定-A對照）=（1.156-0.045）-（0.595-0.271）=0.787，標曲y=0.8502x+0.0217，x=0.900µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：
丙酮酸含量（µmol/g 質(zhì)量）= x×V樣 ÷(V樣÷V提×W) = x÷W =9.00µmol/g 質(zhì)量。
2、 稱取約0.1g鳶尾，加入1mL提取液，冰浴研磨，8000g， 4℃離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定=（A空白1- A空白2）-（A測定-A對照）=（1.156-0.045）-（0.545-0.207）=0.773，標曲y=0.8502x+0.0217，x=0.884µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：
丙酮酸含量（µmol/g 質(zhì)量） = x×V樣 ÷(V樣÷V提×W) = x÷W =8.837µmol/g 質(zhì)量。
3、 收集約500萬細胞，加入1mL提取液，超聲波破碎（功率 200w，超聲3s，間隔10s，重復30次），8000g，4℃離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定= （A空白1- A空白2）-（A測定-A對照）=（1.156-0.045）-（0.770-0.098）=0.439，標曲y=0.8502x+0.0217，x=0.491µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：
丙酮酸含量（μmol/106 cell）= x ×V樣÷（V樣÷V提×5）=0.2 x= 0.098 μmol/106 cell。
4、 吸取0.02mL的馬血清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定= （A空白1- A空白2）-（A測定-A對照）=（1.156-0.045）-（1.139-0.113）=0.085，標曲y=0.8502x+0.0217，x=0.074µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：
丙酮酸含量（μmol/mL）=x×V樣÷V樣= x =0.074μmol/mL。
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0380/BC0385 丙酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒
BC0710/BC0715 α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）活性檢測試劑盒
BC0950/BC0955 琥珀酸脫氫酶（SDH）活性檢測試劑盒
丙酮酸含量檢測試劑盒 微量法 丙酮酸含量檢測試劑盒 微量法
15
化工儀器網(wǎng)