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NAD激酶（NADK）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號：BC1035
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑三：用時加入3 mL雙蒸水，充分溶解，可分裝保存，-20℃保存兩周，禁止反復(fù)凍融；臨用前取出一支稀釋100倍使用。

2. 試劑四：用時加入1 mL雙蒸水，充分溶解，2-8℃保存；

3. 試劑五：用時加入2 mL雙蒸水，充分溶解，2-8℃保存；

4. 試劑六：用時加入2 mL雙蒸水，充分溶解，2-8℃保存；

5. 試劑七：用時加入2 mL雙蒸水，充分溶解，2-8℃避光保存；

6. 試劑八：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。臨用前加入0.986 mL蒸餾水充分溶解，可分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

7. 試劑十：自備95%乙醇；

8. 標(biāo)準(zhǔn)品：加入1.9 mL蒸餾水，即得2 μmol/mL NADP標(biāo)品。臨用前稀釋100倍得20 nmol/mL NADP標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

產(chǎn)品說明：
NADK（EC 2.7.1.23）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前所發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)能夠催化NAD⁺磷酸化生成NADP⁺的酶，可催化NAD(H)以ATP或無機(jī)多聚 磷酸[poly(P)]作為磷酰基供體進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，生成NADP(H)。因此，NAD激酶在合成NADP(H)以及調(diào)節(jié)NAD(H)與NADP(H)的平衡上具有重要作用。

NADK催化NAD⁺磷酸化，生成NADP⁺；NADP⁺可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH；NADPH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（MTT），通過其在570nm的吸光值大小可反映出NADK活性的大小。


注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
臺式離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、無水乙醇、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
注意事項：

1. 樣本的處理必須在0℃-4℃中操作完成，以防止酶變性失活。建議在正式實驗前，選取差別較大的兩個樣本進(jìn)行預(yù)實驗。

2. 試劑三、四、五、六、七、八在測定過程中都必須在冰上放置。

3. 當(dāng)初始吸光值大于0.4時，建議將樣本用PBS稀釋后測量。

1. 若測量樣本數(shù)量過多，可以將試劑二、五、六、七按比例配成工作液使用。

實驗實例：

1. 取0.1大鼠腎臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清稀釋2倍后按照測定步驟操作，使用96孔板測得A測定=0.260，A對照=0.125，計算ΔA測定=A測定-A對照=0.260-0.125=0.135，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0994x-0.0429，計算x=（0.135+0.0429）/0.0994=1.7897，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

NADK（U/g 質(zhì)量）=0.067×x÷W×稀釋倍數(shù)= 0.067×1.7897÷0.1×2=2.3982 U/g 質(zhì)量。

1. 取小鼠血漿稀釋2倍直接檢測，使用96孔板測得A測定=0.093，A對照=0.076，計算ΔA測定=A測定-A對照=0.093-0.076=0.017，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0994x-0.0429，計算x=（0.017+0.0429）/0.0994=0.6026，按血漿體積計算酶活得：

NADK（U/mL）=0.067×x×稀釋倍數(shù)=0.067×0.6026×2=0.0808 U/mL。
參考文獻(xiàn)：

1. Pollak N, Niere M, Ziegler M. NAD kinase levels control the NADPH concentration in human cells[J]. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(46): 33562-33571.

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