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大鼠C反應蛋白ELISA試劑盒

背景介紹：

C 反應蛋白(C-reactive protein ,CRP)是指在機體受到感染或組織損傷時血漿中一些急劇上升的蛋白質(急性蛋白)。CRP 是一種環(huán)狀五聚體蛋白，其一級結構包含 5 個相同的亞單位，亞單位間以非共價鍵相結合，每個亞單位在其表面都含有 CRP 配體結合位點(與配體的結合需Ca 參與)，其另一面含有 Clq 及 FcTR 結合位點。CRP 可以激活補體和加強吞噬細胞的吞噬而起調理作用，從而清除入侵機體的病原微生物和損傷，壞死，凋亡的組織細胞，在機體的天然免疫過程中發(fā)揮重要的保護作用。

檢測原理：

 Solarbio (Solarbio ®)ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯免疫吸附檢測技術。將抗大鼠 CRP 單克隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預稀釋的樣本，標準品和樣本中的大鼠 CRP 會與酶標板上的包被抗體充分結合；洗板后加入生物素化抗大鼠CRP 抗體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的大鼠 CRP 發(fā)生特異性結合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強度的非共價結合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應孔中樣品存在不同濃度的大鼠 CRP，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相關）的藍色物質，加入終止液后反應孔會變成黃色；后，在 λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應孔樣品吸光度（OD），樣本中的
大鼠 CRP 濃度與 OD 成正比，通過繪制標準曲線和四參數擬合軟件便可計算出樣本中大鼠CRP 的濃度。

原理圖：

注意事項：※※※

1. 試劑盒應在有效期內使用，請不要使用過期的試劑。

2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。

3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。

4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持*。

5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容 器。.

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請 用移液器小心吹打幾次。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內含的 試劑代替本試劑盒中的某單個組分。

8. 為保證結果準確，每次檢測均需做標準曲線。

安全提示：試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操 作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本 及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護有關管理規(guī)定執(zhí)行。

試劑盒組成及儲存：

自備實驗器材（不提供，可代購）

1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板機或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水，去離子水，量筒等

6． 稀釋用聚丙烯試管

大鼠C反應蛋白ELISA試劑盒樣本收集及儲存：

1. 細胞培養(yǎng)上清： 將細胞培養(yǎng)基移無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分 裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。

2. 血清樣本： 室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝 于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀， 請再次離心，避免反復凍融。

3. 血漿樣本： 將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作 為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。

※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結果；如果樣本中的靶標 物檢測濃度高于標準品的頂值，請將樣品做適當倍數稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實 驗以確定稀釋倍數。 

試劑準備：

1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現 結晶，請放入 37℃溫浴直到結晶全部溶解。

2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍 濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）0.5ml凍干標準品中，靜置15分鐘待 其*溶解后輕輕混勻(濃度為20000pg/ml)，然后按照以下濃度：20000、 10000、 5000、2500、1250、625、312.5、 0 pg/ml進行稀釋。復溶過的標準品原液 （20000pg/ml）未用完的應廢棄或根據需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃ 冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃 縮液稀釋成1倍應用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內加入到反應孔中。

生物素化抗體工作液具體稀釋方法如下： 

5. 酶結合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶 結合物稀釋成1倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內使用。 酶結合物工作液具體稀釋方法如下： 

酶結合物工作液具體稀釋方法如下：

6. 洗滌方法：

自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。

手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔， 靜止 30 秒后甩凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。 

檢測步驟： 

結果判斷：

1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行 雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。

2.計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應減去零孔的 OD 值

3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中CRP含量 可通過對應OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

4.若標本 OD 值高于標準曲線上限，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數。

參數表征：

1. 數據及標準曲線 

2. 靈敏度：

低可檢測大鼠 CRP 濃度達 150pg/ml， 20 個零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個標準差，計算相應的可檢測濃度。

3. 特異性： 

不與大鼠 SAP，PTX2 反應，人和小鼠 CRP 等反應

4. 重復性：

板內，板間變異系數<10%

5. 回收率：

在選取的健康大鼠血漿、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的大鼠 CRP，計算回收率。

6. 線性稀釋： 分別在選取的 4 份健康大鼠血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度大鼠 CRP，在標準曲線動力 學范圍內進行稀釋，評估線性。 

大鼠C反應蛋白ELISA試劑盒常見問題及解決方法：