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IPTG配制的方法及使用說(shuō)明

閱讀:8268      發(fā)布時(shí)間:2016-4-26
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IPTG是一種作用*的誘導(dǎo)劑,不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定,因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。IPTG溶液的配制很簡(jiǎn)單:在8ml蒸餾水中溶解2g IPTG后,用蒸餾水定容10ml,用0.22μm濾器過(guò)濾除菌,分裝成1ml小份貯存于-20℃。

IPTG的使用方法:

先把IPTG配制成24mg/ml(100mM)的水溶液,并進(jìn)行過(guò)濾除菌后保存。然后在100ml的瓊脂培養(yǎng)基中,加入100μl的上述溶液、200μl的X-Gal(20?mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100μl的Amp(100mg/ml),制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培養(yǎng)基。當(dāng)DNA片段插入pUC系列載體(或其他帶有l(wèi)acZ、Amp基因載體),然后轉(zhuǎn)化lacZ缺失細(xì)胞中后,涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培養(yǎng)基,可根據(jù)長(zhǎng)出菌體的藍(lán)白色,而方便地挑選出基因重組體(白色為具有DNA插入片段的基因重組體)。

選用IPTG作誘導(dǎo)物的原因

能誘導(dǎo)酶的合成,但又不被分解的分子,稱為安慰誘導(dǎo)物(gratuitousinducer)。?由于乳糖雖可誘導(dǎo)酶的合成,但又隨之分解,產(chǎn)生很多復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)問(wèn)題,因此人們常用安慰誘導(dǎo)物來(lái)進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。X-gal(5-溴-4-錄-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一種人工化學(xué)合成的半乳糖苷,可被β-半乳糖苷酶水解產(chǎn)生蘭色化合物,因此可以用作β-半乳糖苷酶活性的指示劑。IPTG和X-gal都被廣泛應(yīng)用在分子生物學(xué)和基因工程的工作中。

某些誘導(dǎo)物與自然的β-半乳糖苷酶相似,且不能?被酶分解,比如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷,(isopropylthiogalactoside,IPTG)。不被細(xì)菌分不被細(xì)菌分解性質(zhì)穩(wěn)定,解性質(zhì)穩(wěn)定,它的濃度在實(shí)驗(yàn)中不會(huì)改變。復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)問(wèn)題,便于研究。IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被運(yùn)送。半乳糖苷鍵中用硫代替了氧,失去了水解活性,半乳糖苷鍵中用硫代替了氧失去了水解活性,但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物與酶位點(diǎn)的親和力相同,雖不為β-半乳糖苷酶所識(shí)的親和力相同,IPTG雖不為半乳糖苷酶所識(shí)雖不為但它是lac基因簇十分有效的誘導(dǎo)物

基因簇十分有效的誘導(dǎo)物。但它是基因簇十分有效的誘導(dǎo)物。

IPTG是β–半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)?;谶@個(gè)特性,當(dāng)pUC系列的載體DNA(或其他帶有l(wèi)acZ 基因載體DNA)以lacZ 缺失細(xì)胞為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)、或用M13噬菌體的載體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)。

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