蛋白質濃度測定的方法有很多,考馬斯亮藍測定蛋白質是實驗室常見的一種方式,它利用比色法和色素法混合方法、操作簡便,
考馬斯亮藍測蛋白質原理:
考馬斯亮藍G-250(Coomassie?brilliant?blue?G-250)測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。該染料在游離狀態(tài)下呈紅色,在稀酸溶液中當它與蛋白質的疏水區(qū)結合后變?yōu)榍嗌罢叽蠊馕赵?65nm,后者在595nm在一定蛋白質濃度范圍內(1-1000μg),蛋白質與色素結合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質含量成正比,故可用于蛋白質的定量測定。
考馬斯亮藍G-250于蛋白質結合反應十分迅速,2min左右即達到平衡。其結合物在室溫下1h內保持穩(wěn)定。此法靈敏度高,易于操作,干擾物質少,是一種比較好的定量法。其缺點是在蛋白質含量很高時線性偏低,且不同來源蛋白質與色素結合狀況有一定差異。
材料、儀器設備及試劑
1、材料
小麥葉片、馬鈴薯塊莖、或其他植物材料
2、儀器設備<
分光光度計、研缽、燒杯、移液管
3、試劑
(1)標準蛋白質溶液:100μg·Ml-1牛血清白蛋白:稱取牛血清白蛋白25mg,加水溶解并定容100ml,吸取上述溶液40ml,用蒸餾水稀釋100ml即可。
(2)考馬斯亮藍G-250溶液:稱取100mg考馬斯亮藍G-250,溶于50ml90%乙醇中,加100ml85%(W/V)的磷酸,再用蒸餾水定容到1L,貯于棕色瓶中,常溫下可保存一個月。
考馬斯亮藍測蛋白質方法:
(1)標準曲線的繪制?取6支具塞試管,按表加入試劑?;旌暇鶆蚝螅蚋鞴苤屑尤?ml考馬斯亮藍G-250溶液,搖勻,并放置5min左右,在595nm下比色測定吸光度。以蛋白質
濃度為橫坐標,以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。
樣品測定
樣品提取:取鮮樣0.5g,加入2ml蒸餾水研磨,磨成勻漿后用6ml蒸餾水沖洗研缽,洗滌液收集在同一離心管中,在4000r/min下離心10min,棄去沉淀,上清液轉入容量瓶,以蒸餾水定容10ml,搖勻后待測
(2)吸取樣品提取液0.1ml,放入具塞試管中(每個樣品重復2次),加入5ml考馬斯亮藍<
G-250溶液,充分混合,放置2min后在595nm下比色,測定吸光度,并通過標準曲線查得蛋白質含量。
(3)結果計算(單位mg/g)樣品中蛋白質含量=(C·VT)/(1000?VS·WF)
(參考文獻:郝建軍,康宗利,于洋,植物生理學實驗技術,北京:化學工業(yè)出版社,2006.12,107-109)
注意事項
在試劑加入后的5-20 min內測定光吸收,因為在這段時間內顏色是穩(wěn)定的。
測定中,蛋白-染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上,測定完后可用乙醇將藍色的比色杯洗干凈。
利用考馬斯亮藍法分析蛋白必須要掌握好分光光度計的正確使用,重復測定吸光度時,比色杯一定要沖洗干凈,制作蛋白標準曲線的時候,蛋白標準品好是從低濃度到高濃度測定,防止誤差
立即詢價
您提交后,專屬客服將第一時間為您服務