WB常見問題
常見問題 | 解決對策及注意事項 |
兩快玻璃板之間灌膠,膠總是不平 | 玻璃沒有洗干凈，應該要洗得非常干凈 |
過硫酸銨和TEMED的加量不合適，加量相對較多，凝膠凝固過快，也會造成膠不平現(xiàn)象 | |
加完試劑以后沒有很好的搖勻，導致有些部位的聚合劑濃度過高，聚合相對較快造成膠不平 | |
膠總是漏 | 避免玻璃邊緣（與膠條接觸處）破損 |
膠條一定要干，跑完電泳后，膠條就放在實驗臺上晾著。下面的膠條注意不要老化，如果有裂紋的話用保鮮膜墊在上面，也可以有效防止漏膠 | |
將兩塊玻板擺放*對齊，底部處于同一個平面 | |
膜上有明顯氣泡 | 操作時將氣泡*排除 |
靠膜一側(cè)的濾紙應鋪平 | |
特異性低 | 優(yōu)化一抗 |
提高一抗和二抗的稀釋度 | |
降低SDS-PAGE中蛋白的上樣量 | |
背景高 | 優(yōu)化封閉液 |
優(yōu)化洗滌緩沖液，增加洗滌次數(shù) | |
減少曝光時間 | |
較低的信號 | 優(yōu)化一抗 |
濃縮樣品 | |
選擇更高敏感度的發(fā)光底物 | |
條帶跑得比正常的窄 | 可能因為膠凝的不均勻，聚合的不是很好，灌膠的時候盡量混勻 |
可能是樣品的問題，如果鹽濃度較高，便會擠壓其它條帶，致使條帶寬窄不一，由于同樣的原因，樣品在凝膠中的速度會很慢，造成條帶走的較慢 | |
可能是系統(tǒng)的ph出了問題，有可能是電極緩沖液，也有可能是凝膠緩沖液，更新緩沖液。 | |
條帶呈“微笑”和“倒微笑”效果 | "微笑"是因為灌膠的時候冷卻不均勻，中間部分冷卻不好，導致凝膠中的分子有不同的遷移率所致。 |
“倒微笑“現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當凝膠和玻璃板組成的三明治底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不*便會產(chǎn)生這種現(xiàn)象 | |
凝膠腫脹或卷曲 | 注意轉(zhuǎn)膜之前，切割下來的凝膠一定要在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡平衡5-10分鐘，要含有20%的甲醇。 |
WB注意事項
1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。
2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。
3）因為DEPF膜的疏水性，膜必須先在甲醇中*浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時保持濕潤（干膜法除外）。
4）濾紙可以重復利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過的蛋白質(zhì)，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。
5）轉(zhuǎn)移時間一般為1.5 小時，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時間和電流大小。
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