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人P16蛋白酶聯(lián)免疫檢測

閱讀:1675      發(fā)布時間:2010-10-18
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P16蛋白酶聯(lián)免疫檢測
 
使用前仔細(xì)閱讀本說明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于雙抗體夾心技術(shù)原理,來檢測人P16蛋白,只能用于研究用途,不得用于醫(yī)學(xué)診斷。
 
本試劑盒采用的是雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定樣品中人P16蛋白的水平。向預(yù)先包被了人P16蛋白克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入P16蛋白,溫育;洗滌后,加入HRP標(biāo)記過的P16蛋白抗體。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶,然后加入底物AB,產(chǎn)生藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺與樣品中人P16蛋白的濃度呈正相關(guān)。
試劑盒組成

1
標(biāo)準(zhǔn)品(16μg/ml
0.5ml
7
顯色劑A液
6ml
2
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
3ml
8
顯色劑B液
6ml
3
酶標(biāo)包被板
12孔×8條
9
終止液
6ml
4
酶標(biāo)試劑
6ml
10
說明書
1份
5
30倍濃縮洗滌液
20ml
11
封板膜
2張
6
樣品稀釋液
6ml
12
密封袋
1個

需要而未提供的試劑和器材
1.   37℃恒溫箱。
2.   標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
3.   精密移液器及一次性吸頭
4.   蒸餾水,
5.   一次性試管
6.   吸水紙
注意事項(xiàng)
1.   從2-8℃取出的試劑盒,在開啟試劑盒之前要室溫平衡少30分鐘。酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2.   各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差
3.   建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本都做雙份檢測。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再按說明書操作進(jìn)行測定,計算時請后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
4.   嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
5.   為避免交叉污染,要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。
6.   不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
7.   底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法:甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將稀釋后的洗滌液少0.35ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中
標(biāo)本要求
1不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
2.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融
操作程序
1.   標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:(本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋):

8μg/ml
5號標(biāo)準(zhǔn)品)
120μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
4μg/ml
4號標(biāo)準(zhǔn)品)
120μl5號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2μg/ml
3號標(biāo)準(zhǔn)品)
120μl4號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
1μg/ml
2號標(biāo)準(zhǔn)品)
120μl3號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0.5μg/ml
1號標(biāo)準(zhǔn)品)
120μl2號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2.   分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50μl;在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品終稀釋度為5倍)。輕輕晃動混勻,37溫育30分鐘。  
3.   棄去液體,甩干,每孔加滿稀釋后洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。如此重復(fù)5次,拍干。
4.   每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。輕輕晃動混勻,37溫育30分鐘。  
5.   棄去液體,甩干,每孔加滿稀釋后洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。如此重復(fù)5次,拍干。
6.   每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37避光顯色10分鐘.
7.   取出酶標(biāo)板,每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。
8.   測定:以空白孔調(diào)零,在450nm波長下測量各孔的吸光度值(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
9.   根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。應(yīng)記住由于樣品稀釋了的,其實(shí)際濃度應(yīng)該乘以總稀釋倍數(shù)。
操作程序總結(jié)
準(zhǔn)備試劑,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品
 


 

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品,37℃反應(yīng)30分鐘
 
 


 

洗板5次,加入酶標(biāo)試劑,37℃反應(yīng)30分鐘
 
洗板5次,加入顯色液A、B,37℃顯色10分鐘
 
加入終止液
 
15分鐘之內(nèi)讀OD值
 
計算
 
檢測范圍:0.2μg/ml→10μg/ml。
規(guī)格:    96T/
保存:    2-8
有效期:  6個月(2-8℃)。

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