RNA提取
RNA提取試劑盒簡介：
RNA是一種重要的遺傳信息分子，因此完整RNA的提取和純化，是進行Northern雜交、RT-PCR、定量PCR等RNA相關研究的重要前提。
RNA提取的原理與方法：
細胞中的RNA可以分為信使RNA、轉運RNA和核糖體RNA三大類，這三類RNA都存在于細胞質中,因此不同組織總RNA提取的實質就是將細胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除蛋白、DNA等雜質，終獲得高純RNA產(chǎn)物的過程。
RNA提取流程
一、樣品處理
從各種不同來源樣品(如細菌、酵母、血液、動物組織、植物組織和培養(yǎng)細胞)，或同一來源樣品的不同組織(如植物幼嫩葉片、成熟根、莖等)中提取高質量的RNA，因細胞結構及所含的成分不同，樣品預處理的方式也各有差異。針對常用的提取材料，下面簡單介紹常規(guī)樣品預處理方法，若想了解具體操作步驟，請參照各類型樣品RNA提取操作步驟。
提取樣品的要求
好使用新鮮樣品或取樣后立即在低溫(-20℃或-70℃)冷凍保存的樣品， 避免反復凍融，因為這會導致提取的RNA降解和提取量下降。
樣品預處理方式
植物材料——液氮研磨
動物材料——勻漿、液氮研磨
培養(yǎng)細胞——蛋白酶K處理
細菌——溶菌酶破壁
酵母——酵母破壁酶或玻璃珠處理
二、細胞裂解
異硫氰酸胍/苯酚法
異硫氰酸胍/苯酚法是一種傳統(tǒng)的RNA提取方法，適用于大部分動植物材料，但對于次生代謝產(chǎn)物較多的植物材料提取RNA效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復合體解離，并將RNA釋放到溶液中，采用酸性酚/混合液抽提，低pH值的酚將使RNA進入水相，而蛋白質和DNA仍留在有機相，從而可以完成RNA的提取工作。
Solarbio公司的TRIquick和總RNA提取試劑盒就是基于異硫氰酸胍/苯酚法開發(fā)的一種總RNA提取試劑和試劑盒。TRIquick法應用非常廣泛，適用于包括動物組織、微生物材料、培養(yǎng)細胞等在內的各類動物性材料，同時還適用于次生代謝物較少的植物性材料，如幼苗、幼葉等。而總RNA提取試劑盒法主要應用在動物組織和培養(yǎng)細胞的RNA提取中，這種方法采用吸附性材料來純化RNA，因此與TRIquick法相比，總RNA提取試劑盒提取RNA具有純度更高的特點。
胍鹽/β-巰基乙醇法
適用于各種不同動物材料和次生代謝物少的植物材料。在這種方法中，胍鹽使細胞充分裂解，β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實驗全程中可以抑制RNase的活性，保護RNA不被降解。
三、RNA純化及獲得
純化要求
RNA樣品中不應存在對酶(如逆轉錄酶)有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染。
純化方法及沉淀
1、有機溶劑抽提法
抽提：在使用RNA提取試劑進行RNA提取時，常使用進行抽提，以去除蔗糖、蛋白等雜質，并促進水相與有機相的分離，從而達到純化RNA的目的。沉淀：抽提RNA后，一般采用異丙醇或乙醇來沉淀水相RNA。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉淀20-30分鐘，高速離心，可獲得RNA沉淀。
洗滌沉淀：加入無RNase的75％乙醇，將RNA沉淀振蕩懸浮，使RNA沉淀中的鹽離子被充分溶解。然后再離心10-30分鐘，再次沉淀RNA。離心后，小心倒掉上清(注意不要倒出RNA沉淀)，隨后快速離心1-2秒，將殘留在管壁上的乙醇收集到管底后，用小槍頭吸凈，超凈臺中風干1-2分鐘(注意不要晾得太干，否則RNA沉淀不易溶解)。
溶解沉淀：加入適量的RNase-free ddH 2 O溶解RNA沉淀。
2、硅基質吸附法
隨著實驗方法的改進，現(xiàn)已發(fā)展出一種采用吸附材料純化核酸的方法。目前較常見的有：硅基質吸附材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。硅基質吸附材料因其具有可特異吸附核酸，使用方便、快捷，不使用有毒溶劑如苯酚等優(yōu)點，成為核酸純化的。
Solarbio公司總RNA提取試劑盒就是采用硅基質吸附達到RNA分離純化目的。通過專一結合RNA的離心吸附柱和*的緩沖液系統(tǒng)，使樣品在高鹽條件下與硅膠膜特異結合，而蛋白、有機溶劑等雜質不能結合到膜上而被洗脫，鹽類則被含有乙醇的漂洗液洗滌，后用RNase-free ddH 2 O將RNA從硅膠膜上洗脫下來。
一些特殊組織的RNA提取
纖維組織：心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關鍵在于*破碎組織。這些組織細胞密度低，單位重量的組織中RNA含量較低，建議增加起始量。此外，一定要在液氮中將組織*磨碎。蛋白/脂肪含量高的組織：腦或植物脂肪含量高，酚抽提后，上清含白色絮狀物。必須用再次對上清進行抽提。
核酸RNase含量高的組織：脾、胸腺等組織的核酸和RNase含量很高。在液氮中研磨，再快速勻漿，能有效滅活RNase，如加入裂解液后過于粘稠，酚抽提不能有效分層，則加入更多裂解液可以解決此問題。多次酚抽提可以去除更多殘留的DNA。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成，表明可能有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚再次抽提或者用DNaseI消化，去除DNA污染，植物組織和真菌組織：植物組織和真菌組織比動物組織更為復雜，一般選擇在液氮條件下對樣品進行研磨，以避免內源RNase降解RNA。如果RNA降解問題不能解決，大多數(shù)情況下是樣品中含有的雜質所致。許多植物和真菌中所含雜質如多糖、多酚等都會殘留，因為這些雜質分子與RNA有一些相似性，可與RNA同時沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的提取中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑來去除多糖多酚等雜質的干擾和污染。
四、RNA評價與鑒定
提取得到RNA溶液后，我們需要對RNA進行相關的質量檢測，以確定它是否符合后續(xù)實驗的要求。RNA用于不同的后續(xù)實驗，對其質量要求不盡相同。cDNA文庫構建要求RNA完整且無酶等抑制物殘留；Northern blot實驗對RNA完整性要求較高，對酶反應抑制物殘留要求較低；RT-PCR實驗對RNA完整性要求不太高，但對酶反應抑制物殘留要求嚴格。因此在進行不同的實驗時應選擇不同的方法純化RNA，以達到佳的實驗效果。
RNA得率檢測——分光光度計法
RNA得率有很強的組織特異性，不同組織RNA的豐度和RNA提取的難易程度共同決定了該種組織的RNA得率。一般來說，可通過分光光度計測定RNA溶液在260nm處的吸光值來計算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液渾濁度、雜質(多肽、苯酚等)濃度和蛋白等有機物的吸收值。用標準樣品測得在波長260nm處，1μg/ml RNA鈉鹽吸光度為0.025(光程為1cm)，即OD 260 =1時，樣品中RNA濃度為40μg/ml。通常分光光度計OD 260 的讀數(shù)要介于0.15-1.0之間才是可靠的，因此RNA提取結束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當濃度范圍，再用分光光度計檢測。
按下面的公式計算總RNA濃度：
總RNA濃度(μg/ml)= OD 260 ×稀釋倍數(shù)× 40μg/ml
RNA純度檢測——分光光度計法
通過OD 260/280 來檢測RNA純度，OD 260/280 作為參考值。
OD 260/280 在1.9-2.1之間，可以認為RNA的純度較好；
OD 260/280 值小于1.8，則表明蛋白雜質較多；
OD 260/280 值大于2.2，則表明RNA已經(jīng)降解；
OD 260/280 值小于2.0，則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙醇殘留。
注意：如果用TE溶解或洗脫RNA，會使OD 260/280 值偏大。
RNA完整性鑒定——瓊脂糖凝膠電泳
變性電泳：
我們可以通過RNA變性電泳，來鑒定RNA的完整性，但一般情況下常規(guī)電泳檢測即可。
RNA變性電泳方法如下：
1、凝膠制備：1.2％瓊脂糖凝膠
2、上樣電泳
①電泳混合液的制備：
10×甲醛變性電泳緩沖液 1.25ul
37％甲醛 2.2ul
甲酰胺 6.25ul
②加入RNA
③混合后1000-2000rpm離心5-10秒
④55℃加熱15分鐘
⑤加入2.5 μl甲醛凝膠上樣緩沖液，混合后離心5秒
⑥將樣品加入點樣孔
⑦在5 V/cm的電壓下電泳溴酚藍帶跑到電泳槽中央(20cm長電泳槽，95V電壓，1小時左右)。
rRNA占總RNA的80-85％，在瓊脂糖凝膠上可以清晰地看到28S(23S)和18S(16S)rRNA。如28S rRNA的量約為18S rRNA的兩倍，說明RNA完整性較好。
常規(guī)電泳：
由于變性電泳操作步驟較為復雜，所以在要求不太嚴格的實驗中，RNA的檢測可以通過常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳進行。一般1％左右的凝膠就可以。按常規(guī)電泳配制好凝膠和電泳溶液，總RNA在普通瓊脂糖凝膠電泳上顯示條帶與變性電泳一致。
五、RNA的保護
與DNA提取實驗相比，RNA的提取實驗常常較為困難，這主要是由于RNA非常容易降解。而造成RNA降解的原因來自內因和外因兩個方面。內因：RNA核糖殘基的2’和3’位置帶有羥基，易被水解；外因：生物體內和外部環(huán)境中存在大量RNase，并且RNase不易失活，高溫后仍然能夠正確折疊恢復活性。因此， 從樣品的儲存、 RNA的提取以及RNA提取完成后的保存， 我們都需要格外小心， 處處防范RNase對RNA的降解作用。 下面， 我們將介紹RNA提取過程中保護RNA的措施。
1、提取前的RNA保護
材料樣品中的RNA保護：一般而言，在收集材料樣品準備提取RNA時，我們先應該選擇新鮮的材料，取樣后迅速液氮研磨或勻漿處理，以保證我們所要提取材料中的RNA本身是完整的。如果收集好材料后，不能馬上進行RNA的提取工作，就需要先將材料保存好，冰凍材料保證低溫儲存，防止反復凍融，以保證材料中的RNA在保存過程中不被降解。液氮低溫保存法是一種常用的保存方法。先將材料在液氮中速凍后保存于-70℃冰箱或直接保存在液氮中。
實驗室中RNA提取工作區(qū)RNase的清除：自然界中的RNase含量非常豐富，在空氣中會有許多RNase存在。因此，在RNA提取實驗中應該辟出RNA提取專區(qū)，該區(qū)域要進行RNase的清除處理，同時要注意避免同其它實驗區(qū)發(fā)生交叉污染。
實驗耗材、玻璃器皿上的RNase的清除：
所有提取RNA要用到的耗材和器皿都要進行RNase清除處理。使用無RNase的塑料制品、槍頭、移液器、電泳槽等避免交叉污染，實驗臺面等要*處理。RNA處在TRIquick試劑中是不會被RNase降解的，但提取后的繼續(xù)處理過程中應使用不含RNase的塑料或玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時以上，塑料器皿可用DEPC處理后再高壓滅菌，即可去除RNase。實驗所用的試劑或溶液，必須確保無RNase。 配制溶液應使用無RNase的水。
2、提取過程中的RNA保護
組織破碎過程中的RNA保護：選擇合適的勻漿方法，盡可能減少勻漿的時間，保持低溫勻漿。在進行細胞裂解之前，一般要先將組織塊破碎。破碎所采用的方法主要有液氮研磨或勻漿處理。液氮研磨時注意不要讓液氮揮發(fā)干凈，因為液氮可以充分抑制RNase，一旦液氮揮發(fā)干凈，就可能造成內源RNase對RNA的降解作用。
細胞裂解過程中的RNA保護：選擇合適的裂解液，裂解液的量要足夠，裂解要充分。在裂解液加量一定的情況下，所加入的提取材料的量就應該按說明書中的比例加入，如果材料太多，會造成裂解不充分和RNase抑制不充分的雙重后果，從而使RNA的得率、完整性和純度都受到破壞。
實驗人員的注意事項：在提取RNA的過程中，實驗操作者本身也應該注意相關問題。因為我們的手上、唾液中都會有大量的RNase存在， 所以在進行RNA提取實驗時， 應該戴上口罩，并及時更換手套。這不僅是對RNA的保護措施， 同的也是對實驗操作者自身的保護。
3、保存過程中的RNA保護
在經(jīng)過從材料采集到RNA提取等一系列精心地準備和實驗之后，我們終于得到了高質量的RNA，那么接下來的RNA保存就成為重點問題，而其中關鍵的問題就是如何避免保存過程中的RNA降解。
RNAwait就是在RNA保存過程中常用的一種RNase抑制劑，它能夠去除溶液中可能存在的RNase污染，保證RNA完整性不受破壞。
4、后續(xù)實驗中的RNA保護
RNA的提取歸根到底只是一個基礎實驗，這就意味著我們還要用RNA來完成許多后續(xù)實驗，例如：RT-PCR，Northern blot，體外轉錄和翻譯等。 那么在這些后續(xù)實驗中， 也需要對RNA進行持續(xù)的保護， RNasin就是在這類后續(xù)實驗中的應用廣泛的RNase抑制劑。
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