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pCold-SUMO 原核蛋白表達試劑盒
原核蛋白表達試劑盒簡介 【* 4000/盒 】
本試劑盒所包含的原核表達載體（pCold-SUMO）是在pCold載體基礎(chǔ)上改造而成（Solarbio ），該載體啟動子（CS Promoter）來源于南極嗜冷細菌
，在低溫下（15度）才能啟動蛋白的表達。低溫下細菌生長緩慢，使得蛋白合成速度減慢，從而大限度的提高了蛋白正確折疊的幾率，提
高了蛋白可溶性表達，增強了活性蛋白的表達比率。該表達系統(tǒng)所包含的SUMO tag可以極大地提高小分子量蛋白的表達量，而且進一步提
高了蛋白的可溶表達幾率。同時，試劑盒配備的SUMO Protease（含6×His標簽）可特異性去除SUMO tag，從而得到不含任何標簽的重組蛋白。
原核蛋白表達試劑盒操作方法
I. 重組質(zhì)粒構(gòu)建
1.根據(jù)目的基因選擇合適的酶切位點，將pCold-SUMO載體和插入片段分別進行雙酶切
2.酶切完成后 經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，將線性載體進行凝膠回收（Solarbio, D1200） 。
3.連接反應(yīng)（以SolarbioT4連接酶為例）
4.取5 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入*0 感受態(tài)細胞（Solrbio ,C1200） ，通過測序鑒定重組質(zhì)粒。
II. 重組蛋白表達
1. 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達宿主菌ArcticExpress或BL21（DE3）、BL21（DE3）plys、Origami等感受態(tài)細胞）。
2. 挑選生長良好的菌落，接入LB培養(yǎng)基（含40-100ug/ml氨芐青霉素），37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.2-0.6。
4. 待培養(yǎng)基冷卻至15℃后，再靜置30min。
5. 加入適量IPTG（0.1-1 mM）,15℃振蕩培養(yǎng)24h。
6. 4,000 rpm室溫離心15min，收集細胞。
7. 用重懸液重懸細胞（含PMSF或Protease Inhibitor Cocktail），并置于冰上破碎。
8. 破碎后使用SDS-PAGE膠檢測蛋白的表達及可溶性表達情況。
III. 蛋白純化
1.融合SUOM標簽的重組蛋白含有6×His標簽，重組蛋白可通過Ni-NTA Resin（Solarbio, C0401）進行純化。詳細的純化操作步驟請參考Solrbio Ni-NTA
Resin（Solarbio ，C0401）說明書。
2.SUMO標簽分子量為15KD。融合SUOM標簽的重組蛋白可通過SUMO Protease切割去處SUMO標簽，SUMO Protease切割位點見圖譜。切割后
SUMO標簽含6×His標簽、目的蛋白不含有6×His標簽，所以可通過Ni-NTA Resin（Solarbio, C0401） 將SUMO標簽和未*切割的融合蛋白
與不含SUMO標簽的目的蛋白分離純化。
3.本SUMO Protease蛋白分子量為31KD,并含有6×His標簽可通過Ni-NTA Resin去除。
注意：對于大部分融合蛋白，SUMO Protease的理想反應(yīng)液中的NaCl濃度為150mM。然而，根據(jù)實際情況可在100 mM～300 mM之間調(diào)節(jié)NaCl
的濃度以達到佳效果。若蛋白為熱不穩(wěn)定性，請在4°C孵育較長時間或增加酶的用量。
（2）. 混勻上述體系后于30°C 孵育，在1、2、4、6小時分別吸出30 μl上述反應(yīng)液，分別置于EP管中。
（3）. 向上述EP管中加入6 μl 5XSDS Loading Buffer，置于-20°C。
（4）. 取30 μl樣品進行SDA-PAGE 分析。
原核蛋白表達試劑盒
上海索萊寶生物科技有限公司
Shanghai solarbio Bioscience & Technology Co.,LTD
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