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Ø 超氧化物檢測(cè)試劑盒（Superoxide Assay Kit）是一種用于超氧化物快速高靈敏度檢測(cè)的試劑盒。

Ø 本試劑盒利用超氧化物可以還原WST-1產(chǎn)生可溶性有色物質(zhì)為基礎(chǔ)來檢測(cè)超氧化物。本試劑盒的檢測(cè)試劑中添加了Catalase（觸酶）等，可以清除過氧化氫等過氧化物對(duì)WST-1顯色的干擾，使測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確。并且本試劑盒還提供SOD（超氧化物歧化酶），可以驗(yàn)證本試劑盒測(cè)定出的結(jié)果是否為超氧化物，以排除檢測(cè)體系中所用的一些試劑可能產(chǎn)生的干擾。對(duì)于本試劑盒，加入SOD后通常可以抑制90％以上的超氧化物。 

Ø WST-1是一種類似于MTT的化合物，可以被超氧化物還原生成橙色的formazan。超氧化物產(chǎn)生越多越快，則顏色越深，即相應(yīng)測(cè)定得到的吸光度值越大。   

Ø 使用WST-1作為檢測(cè)試劑比用傳統(tǒng)的細(xì)胞色素c（cytochrome c）檢測(cè)超氧化物具有多方面的優(yōu)點(diǎn)。首先，WST-1本身的吸光度非常低（通常OD450為0.02左右，因儀器和酶標(biāo)板不同而有所不同），而細(xì)胞色素c本身的吸光度非常高（通常OD550為0.5左右），因此，使用WST-1與細(xì)胞色素c相比，檢測(cè)靈敏度高很多倍。其次，WST-1的還原產(chǎn)物是穩(wěn)定的可溶性產(chǎn)物，且對(duì)細(xì)胞基本無毒性，使WST-1方法更加適合于高通量的篩選。另外，細(xì)胞色素c法由于靈敏度的限制，一般不適合用96孔板測(cè)定，而WST-1法可以用96孔板測(cè)定，使檢測(cè)更加便捷。用WST-1法或細(xì)胞色素c法對(duì)超氧化物測(cè)定效果比較參考圖1。圖1中，50萬/毫升嗜中性粒細(xì)胞在37℃用PMA刺激時(shí)間，用WST-1或細(xì)胞色素c方法分別測(cè)定。WST-1法測(cè)定OD450，而細(xì)胞色素c法測(cè)定OD550。另外，WST-1法和luminol法相比，靈敏度相近，但僅須使用普通的酶標(biāo)儀，無須使用luminol法所需的luminometer，并且檢測(cè)速度也比luminol 圖1. WST-1法和細(xì)胞色素c法對(duì)于法更加快捷。 超氧化物測(cè)定效果的比較。

Ø 超氧化物通常指超氧化物陰離子（superoxide anion）O2·-，是一種氧分子的自由基。在呼吸鏈中，NADPH氧化酶把電子傳遞給氧分子的時(shí)候，就會(huì)產(chǎn)生超氧化物陰離子）O2·-。 超氧化物陰離子）O2·-是一種強(qiáng)氧化劑，可以由被刺激的白細(xì)胞等產(chǎn)生，從而抵御微生物的感染等。超氧化物陰離子）O2·-也可以導(dǎo)致氧化損傷，和許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

Ø 本試劑盒可以測(cè)定100個(gè)樣品。

產(chǎn)品編號(hào)  產(chǎn)品名稱            包裝

S0060-1  超氧化物檢測(cè)緩沖液 30 ml 

S0060-2   WST-1溶液         1 ml 

S0060-3   Catalase溶液        200微升 

S0060-4   SOD溶液           20微升 

— 說明書 1份

-20℃保存，一年有效。

Ø WST-1溶液、Catalase溶液和SOD溶液均宜盡量避免反復(fù)凍融，可以適當(dāng)分裝。

Ø 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

1. 超氧化物檢測(cè)工作液的配制：

按照下表比例配制超氧化物檢測(cè)工作液：

1個(gè)檢測(cè)   5個(gè)檢測(cè) 10個(gè)檢測(cè)  20個(gè)檢測(cè)   50個(gè)檢測(cè) 

超氧化物檢測(cè)緩沖液 200微升    1毫升    2毫升      4毫升   10毫升 

WST-1溶液          10微升   50微升  100微升    200微升 500微升 

Catalase溶液        2微升    10微升  20微升    40微升 100微升 

超氧化物檢測(cè)工作液 212微升 1.06毫升   2.12毫升  4.24毫升 10.6毫升 

2. 懸浮細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物的檢測(cè)：

a. 細(xì)胞用PBS、Hanks液或生理鹽水洗滌一次。 

b. 約按5-10萬個(gè)細(xì)胞/毫升的比例，用超氧化物檢測(cè)工作液懸浮細(xì)胞。

c. 在96孔板中，每孔加入200微升用超氧化物檢測(cè)工作液懸浮的細(xì)胞，每孔約1-2個(gè)細(xì)胞。

d. 37℃孵育3分鐘。

e. 在預(yù)定的檢測(cè)孔中加入預(yù)計(jì)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生超氧化物的刺激物，如PMA等，刺激10-60分鐘或其它預(yù)定的時(shí)間。須至少留一個(gè)不加刺激物的孔作為空白對(duì)照。選擇1-2個(gè)加刺激物的孔中加入2微升SOD以驗(yàn)證整個(gè)檢測(cè)體系，加SOD溶液的檢測(cè)可以不做。試劑盒提供的SOD溶液足夠做10個(gè)檢測(cè)。具體檢測(cè)時(shí)的安排參考下表： 

細(xì)胞 超氧化物檢測(cè)工作液 刺激物 SOD溶液 

空白對(duì)照 ＋              ＋         －        － 

待測(cè)樣品 ＋              ＋         ＋        － 

陰性對(duì)照 ＋              ＋         ＋        ＋ 

f. 在450nm測(cè)定吸光度。如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片?？梢允褂么笥?00nm的波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。

3. 貼壁細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物的檢測(cè)：

a. 約按每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞（具體的細(xì)胞接種數(shù)量須根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度自行確定）把細(xì)胞培養(yǎng)到96孔板中，使第二天或待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞為80-90%滿。 

b. 吸去培養(yǎng)液，用PBS、Hanks液或生理鹽水洗滌一次。

c. 每孔加入200微升超氧化物檢測(cè)工作液，37℃孵育3分鐘。

d. 在預(yù)定的檢測(cè)孔中加入預(yù)計(jì)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生超氧化物的刺激物，如PMA等，刺激10-60分鐘或其它預(yù)定的時(shí)間。須至少留一個(gè)不加刺激物的孔作為空白對(duì)照。選擇1-2個(gè)加刺激物的孔中加入2微升SOD以驗(yàn)證整個(gè)檢測(cè)體系，加SOD溶液的檢測(cè)可以不做。試劑盒提供的SOD溶液足夠做10個(gè)檢測(cè)。具體檢測(cè)時(shí)的安排參考下表： 

細(xì)胞 超氧化物檢測(cè)工作液 刺激物 SOD溶液

空白對(duì)照 ＋          ＋           －        －

待測(cè)樣品 ＋          ＋           ＋         －

陰性對(duì)照 ＋          ＋           ＋         ＋ 

e. 在450nm測(cè)定吸光度。如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片?？梢允褂么笥?00nm的波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。