Western Blot實驗中濾紙及膜的選擇
Western Blot實驗中濾紙及膜的選擇
Western Blot實驗中濾紙使用的濾紙必須是 WHATMAN 3MM層析濾紙WHATMAN 3MM濾紙【詳細說明】
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1、NC膜、PVDF膜、尼龍膜怎樣鑒別？
解答：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；*纖維素(NC)膜是目前應(yīng)用廣的一種固相支持物，價格便宜；PVDF膜介于二者之間。
就結(jié)合能力而言：尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達480－600μg/cm2，可結(jié)合短至10bp的核酸片段；*纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達80－100μg/cm2，對于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強；PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達125－300μg/cm2。
就溫度適應(yīng)性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合；*纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固；PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。
就韌性而言：尼龍膜較強；*纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強。
就重復性而言：尼龍膜可反復用于分子雜交，雜交后探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來；*纖維素膜不能重復使用；PVDF膜可以重復使用。
2、在做Western Blot時，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。
3、檢測磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎？
解答：可以。
4、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大分子蛋白的一端(即點樣的一側(cè))的轉(zhuǎn)膜不是很好？
解答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢，延長轉(zhuǎn)移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。
5、膜一般要如何處理？
解答：一般用甲醇泡泡就可以了。
6、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到佳效果。
解答：無要求。
7、跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？
解答：沒什么問題，就是膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了。如果過夜，膠里的水分被蒸發(fā)，采用保鮮膜包上也可以；也可能母液(30%聚丙酰胺)有問題，可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑，避免找麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會造成膠縮。
8、膜、濾紙、膠大小有何講究？
解答：如果是用的是半干轉(zhuǎn)，順序為：陰極－濾紙－膠－膜－濾紙。濾紙的長寬比膠的長寬小1－2mm，而膜的長寬分別比膠的長寬大1－2mm。禁忌：上下兩層濾紙因為過大而相互接觸，這樣會短路，電流不會通過膠和濾紙。
9、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？
解答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)36V，3－5hrs就可以了， 可以根據(jù)實驗室的經(jīng)驗調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDS－PAGE， 48V 10hrs－16hrs。
10、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？
解答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇(是指終濃度)(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》)，因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜(0.2微米)；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時間。
11、如何選擇合適的蛋白雜交膜？
解答：蛋白質(zhì)印跡雜交是分子生物學實驗中極為常用的一門技術(shù)。選擇質(zhì)量上層、合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項實驗成敗的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我們要量體裁衣，從雜交膜的材質(zhì)、孔徑和規(guī)格上都要做出合理的選擇。
*纖維素膜：*纖維素膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物。在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負電荷的蛋白質(zhì)會與*纖維素膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，雖然這其中的機制還不是十分清楚，但由于*纖維素膜的這個特性，而且易于封閉非特異性結(jié)合，從而得到了廣泛的應(yīng)用。在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的*纖維素膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。但是膜孔徑如果小于0.1μm，蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進行了。因此，我們通常用0.45μm和0.2μm兩種規(guī)格的*纖維素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就會發(fā)生“Blowthroμgh”的現(xiàn)象。從膜的質(zhì)地上來看，重要的指標就是單位面積上能夠結(jié)合的蛋白的量。*纖維素膜的結(jié)合能力主要與膜的*纖維素的純度有關(guān)，市場上有些*纖維素膜通常會有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結(jié)合量。S&S公司采用的是100%純度的*纖維素，保證了大的蛋白結(jié)合量，可達80-150μg/cm2。由于100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結(jié)合，降低雜交背景，無需高嚴謹度的洗脫步驟。其次，膜的強度和韌性也是需要考慮的因素。常規(guī)的*纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會破損，不能反復使用。
PVDF轉(zhuǎn)移膜：PVDF是一種高強度、耐腐蝕的物質(zhì)，通常是用來制造水管的。PVDF膜可以結(jié)合蛋白質(zhì)，而且可以分離小片段的蛋白質(zhì)，初是將它用于蛋白質(zhì)的序列測定，因為*纖維素膜在Edman試劑中會降解，所以就尋找了PVDF作為替代品，雖然PVDF膜結(jié)合蛋白的效率沒有*纖維素膜高，但由于它的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜與*纖維素膜一樣，可以進行各種染色和化學發(fā)光檢測，也有很廣的適用范圍。這種PVDF膜，靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細工藝下比常規(guī)的膜都要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進行浸泡飽和1-5秒鐘。
離子交換型轉(zhuǎn)移膜：*纖維素和PVDF膜是靠疏水作用結(jié)合蛋白的，還有一類膜是根據(jù)離子交換的方式結(jié)合生物大分子的。由DEAE(二乙氨乙基)修飾的纖維素制成的DEAE陰離子交換膜同樣可以 作為蛋白質(zhì)印跡的固相支持物。DEAE可以有效的結(jié)合陰離子基團，包括那些高于其等電點的蛋白質(zhì)。在pH10以下，DEAE基團都能帶電荷，在低離子強度的轉(zhuǎn)移液中結(jié)合蛋白分子。其適的pH環(huán)境為5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血紅蛋白的研究。這種0.45μm孔徑的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，還可以用于核酸結(jié)合研究。
還有一種離子交換型膜是羧甲基(CM)修飾的纖維素膜，它可以結(jié)合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，適結(jié)合pH范圍在4-7。結(jié)合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來，用于氨基酸系列分析或微測序。
雜交膜轉(zhuǎn)印膜*纖維素膜NC膜與PVDF膜的區(qū)別
雜交膜轉(zhuǎn)印膜*纖維素膜NC膜與PVDF膜的區(qū)別
1. *纖維素膜
*纖維素膜是蛋白印跡廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對蛋白有很強的結(jié)合能力，而且適用于各種顯色方法，包括同位素，化學發(fā)光(Luminol類)、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很簡便，比如不需要甲醛預處理，只要在無離子水面浸潤排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；比如NC膜很容易封閉，也不需要特別嚴謹?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間，不過要注意的是純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復清洗的用途--因為經(jīng)不起多次“折磨”。選擇硝纖膜時要注意的是選擇合適的孔徑，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的，如果小于7KD的話好選擇0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC膜--混有含醋酸纖維(CM)的NC膜結(jié)合力會有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上結(jié)合的蛋白會因為一些去污劑而被代替，因此在封閉時好使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過0.3%(據(jù)說0.05%效果好)。一般而言，NC膜越純，其蛋白結(jié)合能力就越高，所以要增加WB的靈敏度和分辨率，提高所使用膜的純度是個可以考慮的選擇。如果NC膜攙雜一些醋化纖維素--這在前面已經(jīng)提到，會影響蛋白質(zhì)結(jié)合。Protran由于是純NC膜，比較脆，機械耐受力欠佳，需要小心操作，如果擔心自己“粗手粗腳”，那么就可以考慮一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著稱的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。卷膜肯定是實惠的選擇，只不過要自己動手裁剪--切記，必須帶手套操作。
*纖維素膜生產(chǎn)商：
GE WHATMAN BA83 BA85 價格 1950.00/卷 有現(xiàn)貨
GE RPN303C
PALL 66485 常用的NC膜 30cm*3m/卷超低*：1250.00/卷現(xiàn)貨
2. PVDF膜
與*纖維素膜相比，PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力，機械強度和化學相容性上都更*的性能。市售*纖維素膜的典型結(jié)合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜結(jié)合量是100-200μg/cm2(而結(jié)合強度PVDF比硝纖膜強6倍！)。但是PVDF膜大的優(yōu)點不僅于此：更好的機械強度和化學耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測中成為理想選擇；而且單個凝膠的泳道復本可用于多種目的，特別是需要做N端蛋白測序，在相當“嚴酷”的清洗條件下，當尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白測序的*選擇。但不適合熒光。PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預處理(不超過15秒)再用緩沖液平衡，才能用，而且適用過程中萬一干了也要同樣程序再處理(不過要真出現(xiàn)這種問題也是自己欠扁，誰要你不小心呢，轉(zhuǎn)膜前處理也就罷了，轉(zhuǎn)膜后再這樣處理可能會影響后繼的抗體識別呢)。PVDF膜同樣分0.45um和0.2um的，后者孔徑小，對小分子蛋白有較好的攔截吸附，背景可能會比前者稍高。
pvdf膜生產(chǎn)商：
MILLIPORE * 常年 現(xiàn)貨
IPVH00010 0.45um 1650.00/卷
ISEQ00010 0.22um 2050.00/卷
PALL 66543 2150.00/卷
卷膜經(jīng)濟實惠，裁剪剩下的邊角料還可以用來做點雜交。再次強調(diào)的是，疏水PVDF膜在用前必須經(jīng)過50%或以上體積比的甲醇或者乙醇溶液處理幾分鐘，待膜變成半透明后用純水漂洗一下，轉(zhuǎn)入電泳緩沖液平衡才能用
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