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基因診斷的概念  
一、基本概念：  
1．人類的絕大多數(shù)疾病都與基因有關(guān)，基因變異引起疾病兩種類型：  
1) 內(nèi)源基因變異：由于先天遺傳和后天內(nèi)外環(huán)境因素的影響，人類的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)的各個環(huán)節(jié)都可發(fā)生異常，從而導(dǎo)致疾病。分基因結(jié)構(gòu)突變和表達(dá)異常。  
2) 外源基因的入侵：各種病原體感染人體后，其特異的基因被帶入人體并在體內(nèi)增殖引起各種疾病?；蚋淖円鸶鞣N表型改變，從而引起疾病，從基因水平探測分析病因和疾病的發(fā)病機制，并采用針對性的手段矯正疾病是近年基礎(chǔ)和臨床的方向。  
２．基因診斷：利用現(xiàn)代生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。  
二、基因診斷的特點：  
1．以基因做檢查材料和檢查目標(biāo)針對性強；  
2．分子雜交選用特定基因序列作探針，故特異性強；  
3．分子雜交和PCR具有放大效應(yīng)，故有較大的靈敏度；  
4．適用性強，診斷范圍廣。  

基因診斷的常用技術(shù)　  
一、核酸分子雜交：  
核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對規(guī)律形成雙鏈結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測樣品的不同又被分為DNA印跡雜交（Southern blot hybridization ）和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization）。  
（一）核酸分子雜交的基本過程：  
①．DNA或RNA的制備：將待測樣品用一定方法提取DNA或RNA。  
②．制備探針；  
③．雜交；  
④．檢測。  
1．DNA或RNA的制備：將待測樣品用一定方法提取DNA或RNA。  
2．基因探針的概念：  
① 基因探針（probe）就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可以僅僅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。  
② 探針的來源：  
DNA探針根據(jù)其來源有3種：一種來自基因組中有關(guān)的基因本身，稱為基因組探針（genomic probe）；另一種是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，稱為cDNA探針（cDNA probe）。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。此外，還可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補的DNA的片段，稱為寡核苷酸探針。  
③ 探針的制備：  
進(jìn)行分子突變需要大量的探針拷貝，后者一般是通過分子克?。╩olecular cloning）獲得的?？寺∈侵赣脽o性繁殖方法獲得同一個體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。當(dāng)制備基因組DNA探針進(jìn)，應(yīng)先制備基因組文庫，即把基因組DNA打斷，或用限制性酶作不*水解，得到許多大小不等的隨機片段，將這些片段體外重組到運載體（噬菌體、質(zhì)粒等）中去，再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸桿菌，這時在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA的片段的克隆噬菌斑，通過原位雜交，從中可篩出含有目的基因片段的克隆，然后通過細(xì)胞擴增，制備出大量的探針。  
為了制備cDNA 探針，首先需分離純化相應(yīng)mRNA，這從含有大量mRNA的組織、細(xì)胞中比較容易做到，如從造血細(xì)胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，就可以合成與之互補的DNA(即cDNA)，cDNA與待測基因的編碼區(qū)有*相同的堿基順序，但內(nèi)含子已在加工過程中切除。  
寡核苷酸探針是人工合成的，與已知基因DNA互補的，長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。如僅知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量，也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列，并用化學(xué)方法合成。  
④ 探針的標(biāo)記：  
  為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號，通常采用放射性同位素32P標(biāo)記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體，熒光素等作為標(biāo)記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標(biāo)記的優(yōu)點是保存時間較長，而且避免了同位素的污染。常用的探針標(biāo)記法是缺口平移法(nick translation)。