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人 人人 人Ⅳ ⅣⅣ Ⅳ型膠原 型膠原 型膠原 型膠原（Col Ⅳ ⅣⅣ Ⅳ）酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書 試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產(chǎn)品編號 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品編號： ：： ：CSB-E04803h
檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍 檢測范圍： ：： ：3.12 ng/ml - 200 ng/ml
zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限 zui低檢測限： ：： ：0.78 ng/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人 Col Ⅳ，且與其他相關(guān)蛋白
無交叉反應(yīng)。
有效期 有效期 有效期 有效期： ：： ：6 個月
預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用： ：： ： ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中 Col Ⅳ
含量。
說明 說明 說明 說明  
1.  試劑盒保存：未開封的試劑盒應(yīng)儲存于 2-8℃；開封后的酶標(biāo)板應(yīng)與干燥
劑一起儲存于鋁箔袋中置于 2-8℃保存。僅在此出儲存條件下，產(chǎn)品在有
效期內(nèi)可正常使用。
2.  濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。  
3.  中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。
4.  剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實
驗結(jié)果造成任何影響。   2
實驗原理 實驗原理 實驗原理 實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗 Col Ⅳ抗體的微孔
中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗 Col Ⅳ抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，
經(jīng)過*洗滌后用底物 TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，
并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 Col Ⅳ呈正相關(guān)。
用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。  
試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制  
1.  酶聯(lián)板 酶聯(lián)板 酶聯(lián)板 酶聯(lián)板（Assay plate ）：                                                              一塊 （96孔）。   
2.  標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 （Standard）：                                                                   2 瓶（凍干品）。 
3.  樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                                     1×20ml/瓶。 
4.  生物素標(biāo)記抗體稀釋液 生物素標(biāo)記抗體稀釋液 生物素標(biāo)記抗體稀釋液 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（ （（ （Biotin-antibody Diluent） ）） ）：               1×10ml/瓶。 
5.  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （ （（ （HRP-avidin Diluent） ）） ）     1×10ml/瓶。 
6.  生物素標(biāo)記抗體 生物素標(biāo)記抗體 生物素標(biāo)記抗體 生物素標(biāo)記抗體 （ （（ （Biotin-antibody） ）） ）：                           1×120µl/瓶（1： 100）。 
7.  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素 （ （（ （HRP-avidin） ）） ）：             1×120µl/瓶（1： 100）。 
8.  底物溶液 底物溶液 底物溶液 底物溶液 （ （（ （TMB Substrate） ）） ）：                                                       1×10ml/瓶。   
9.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）  1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋 25 倍。   
10. 終止液 終止液 終止液 終止液（ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                                            1×10ml/瓶。 
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材
1.  標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2.  高速離心機
3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.  干凈的試管和 Eppendof 管
5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6.  蒸餾水，容量瓶等   3
標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存  
1.  血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，
取上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但
應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測。
2.  血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后 30 分鐘內(nèi)于 2  -  8°C
1000 g離心 15 分鐘，取上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標(biāo)本放于
-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后
檢測。
3.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心 20 分鐘，取上清即可立即
檢測；或進行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測。
注 注注 注： ：： ：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果 標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果 標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果 標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果， ，， ，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測 因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測 因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測 因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。 。。 。
標(biāo)本的稀釋 標(biāo)本的稀釋 標(biāo)本的稀釋 標(biāo)本的稀釋原則 原則 原則 原則： ：： ：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)
做好詳細(xì)的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。 
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則： ：： ：2 瓶，使用前于 6000-10000rpm 離心 30 秒。 每
瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至 1ml，蓋好后靜置 10 分鐘以上，然后反復(fù)顛倒
/搓動以助溶解，其濃度為 200 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋 200 ng/ml,
100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.25 ng/ml, 3.12 ng/ml，樣品稀
釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度 0  ng/ml，臨用前 15 分鐘內(nèi)配制，用完丟棄，下次檢
測使用新鮮配置的標(biāo)準(zhǔn)品。
如配制 100  ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）200  ng/ml的上述標(biāo)
準(zhǔn)品加入含 0.5ml 樣品稀釋液的 Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此
類推。   4
生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則 生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則 生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則 生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則： ：： ：
打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀
釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔 100µl），實際
配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。如 10µl生物素標(biāo)記抗體加 990µl生物素標(biāo)記抗體
稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則： ：： ：
打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和
素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔
100µl），實際配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2ml。如10µl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素
加 990µl 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用
前一小時內(nèi)配制。
操作步 操作步 操作步 操作步驟 驟驟 驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻
時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品
稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。加樣時，槍頭應(yīng)直接對
準(zhǔn)液面，切勿沿孔壁加樣。
1.  加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?100µl，
余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品 100µl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于
酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，
37℃反應(yīng) 120 分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。   5
2.  棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液  100µl （取 1µl
生物素標(biāo)記抗體加 99µl 生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，
在使用前一小時內(nèi)配制），37 ,60 ℃ 分鐘。
3.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2分鐘，
200µl/每孔，甩干。  
4.  每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液）
100µl，37℃，60 分鐘。
5.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2分鐘，
200µl/每孔，甩干。
6.  依序每孔加底物溶液 90µl，37℃避光顯色（ （（ （30 分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)
準(zhǔn)品的前 3-4 孔有明顯的梯度藍色，后 3-4 孔顯色不明顯，即可終止）。
7.  依序每孔加終止溶液 50µl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加
入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底
物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.  用酶聯(lián)儀在 450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。 在加終止液
后 15 分鐘以內(nèi)進行檢測。
實驗備注 實驗備注 實驗備注 實驗備注
1.  用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到
管底。
2.  每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶
液及終止液。測量時先用此孔調(diào) OD值至零。  
3.  為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上
蓋或覆膜。   6
4.  未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于 2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體
工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請
勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、或辣根過氧化物
酶標(biāo)記親和素工作液。
5.  建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法 洗板方法 洗板方法 洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上
鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml
注入孔內(nèi)，浸泡 1-2 分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算 計算 計算 計算
請從我們的下載專業(yè)軟件"Curve Exert 1.3"，并根據(jù)提示制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對
數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；
再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方
程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即
為樣品的實際濃度。
注意 注意 注意 注意事項 事項 事項 事項
1.  本操作說明適用于 本操作說明適用于 本操作說明適用于 本操作說明適用于 48T 試劑盒 試劑盒 試劑盒 試劑盒， ，， ，  48T 試劑盒中酶聯(lián)板 試劑盒中酶聯(lián)板 試劑盒中酶聯(lián)板 試劑盒中酶聯(lián)板、 、、 、標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品、 、、 、生物素 生物素 生物素 生物素
標(biāo)記抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素減半 標(biāo)記抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素減半 標(biāo)記抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素減半 標(biāo)記抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素減半。 。。 。
2.  當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。   7
3.  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
4.  一次加樣時間控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。 
5.  請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
6.  如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋
倍數(shù)。
7.  在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。 
8.  底物請避光保存。
9.  不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

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