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石蠟標(biāo)本切片的制作
點(diǎn)擊次數(shù):2993 發(fā)布時(shí)間:2017-2-7
在制作石蠟組織切片標(biāo)本的實(shí)踐中,筆者體會(huì)到要做出質(zhì)量好的組織切片標(biāo)本,必須把握制作中的每個(gè)環(huán)節(jié)。為確保組織切片標(biāo)本制作的順利進(jìn)行,現(xiàn)將操作要點(diǎn)介紹如下。
1 取 材
動(dòng)物處死后,應(yīng)快速取出所需的組織。取材的刀要鋒利,嚴(yán)禁用手或鑷子擠壓,以免損傷組織。切取的組織塊厚度一般為0.5~1.0cm,大小1.5~2.0cm,以免影響固定效果。
2 固 定
固定是將組織塊用化學(xué)試劑浸泡,使組織內(nèi)的蛋白質(zhì)等成分迅速凝固或沉淀,停止細(xì)胞瀕死前或死亡后的變化。同時(shí)組織固定后不易變形,有利于以后的組織處理。所以組織一旦離體必須及時(shí)固定,固定液的量大約為組織的5倍。常用10%的福爾馬林、zenker氏等固定液。固定時(shí)間約為24h。
3 沖 洗
固定好的組織塊需經(jīng)流水沖洗24h,沖洗不*容易造成脫片和染色不佳。對(duì)需做免疫組織化學(xué)的組織,更不能忽視這一步驟。
4 脫水和透明
脫水就是利用脫水劑將組織內(nèi)的水分置換出來(lái),以利于有機(jī)溶劑的滲入。脫水是否*,直接關(guān)系到組織能否充分透明。脫水一般采取上行梯度酒精,從80%酒精、95%酒精至*。還要注意組織在*內(nèi)時(shí)間過(guò)久,容易發(fā)脆,一般約為4h。組織塊脫水后就進(jìn)入透明步驟,即經(jīng)過(guò)一種既能與脫水劑混合,又能與石蠟相溶的媒介物質(zhì)。目前的透明劑是二甲苯,但二甲苯容易使組織發(fā)脆,所以在二甲苯中時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng),一般40~60min。
5 浸 蠟
組織透明后,在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過(guò)程稱為浸蠟。浸蠟溫度過(guò)高(超過(guò)70℃),會(huì)導(dǎo)致組織發(fā)硬,還會(huì)使組織內(nèi)的抗原受到破壞。浸蠟用的石蠟熔點(diǎn)一般在56℃~60℃,浸蠟溫度控制在60℃~70℃。浸蠟時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響組織切片,不同的組織浸蠟時(shí)間不同,通常較脆組織如肝、甲狀腺、脾等浸蠟2~3h,含有結(jié)締組織的器官如胃、膀胱、腸等浸蠟時(shí)間要延長(zhǎng)6h。所用的石蠟如有雜質(zhì)盡可能過(guò)濾,以防附著在組織上,影響切片與觀察。
6 包 埋
用包埋劑來(lái)支持組織的過(guò)程稱為包埋。zui常用的是石蠟包埋法。包埋的關(guān)鍵是平整和方位。包埋時(shí),要求用鑷子輕壓組織塊拱起部份,使之平貼于底部,通常采用組織的zui大面包埋;囊壁、管腔組織應(yīng)豎直包埋。修去兩邊的余蠟(指切片時(shí)與切片刀垂直的兩側(cè))。
7 切 片
切片的*步需粗切。粗切的厚度20~40μm,粗切至組織全部暴露后,再進(jìn)行細(xì)切。細(xì)切至組織塊表面均勻一致,無(wú)白點(diǎn)。切片時(shí)要求用力均勻、柔和,切片厚度一般為3~5μm,切下的蠟?zāi)ご笮 ⑿螤顟?yīng)與組織塊上的組織大小形狀一致。如氣溫較高,石蠟組織塊較軟可用冰塊局部冰凍(操作狀態(tài)下),使組織塊變硬便于做連續(xù)性切片;如氣溫較低、石蠟組織塊較硬時(shí)可用大拇指熱敷或用嘴吹氣加溫,使組織塊變軟再做連續(xù)性切片。
8 展片與撈片
把切片放入溫水中展開(kāi)即為展片。展片水溫應(yīng)在48℃~55℃,這主要和包埋蠟的熔點(diǎn)有關(guān):水溫過(guò)高,會(huì)引起組織細(xì)胞散開(kāi);水溫過(guò)低,切片皺摺無(wú)法攤平。展開(kāi)片子上的皺摺,有兩個(gè)方法:①在切片時(shí)邊切邊向蠟片吹氣,這樣片子放到熱水里會(huì)自然展平;②切片結(jié)束后,先把切片放在30%酒精水溶液中,讓酒精的張力自動(dòng)把皺摺展開(kāi),然后再將切片移到熱水中,酒精濃度不宜過(guò)高,否則容易引起切片破碎,出現(xiàn)裂隙。脂肪類組織遇到酒精會(huì)散開(kāi),故不能用此法。撈片時(shí),要選擇那些完整、無(wú)皺摺的切片,粘貼于載玻片上。
9 烤片和脫蠟
烤片是烤干切片上多余的水分和石蠟,并使切片與載玻片牢固粘貼。一般在60℃的溫箱內(nèi)進(jìn)行,溫度過(guò)高,會(huì)引起切片的組織細(xì)胞收縮;時(shí)間太短(少于20min),容易造成脫片。脫蠟也相當(dāng)重要,如果脫蠟不干凈,切片不易著色或著色不勻。所以在脫蠟過(guò)程中,脫蠟劑(松節(jié)油)要常更換(用15~20次)??酒Y(jié)束后立即將切片放在溫箱內(nèi)預(yù)熱(40℃~45℃)的松節(jié)油Ⅰ、Ⅱ中15min,然后經(jīng)下行梯度酒精洗去松節(jié)油至水。
10 染 色
按常規(guī)的HE染色。染色理想的切片在顯微鏡下應(yīng)是細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)藍(lán)紅相映,色澤鮮艷,核漿對(duì)比明顯,核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見(jiàn)。
11 脫水和封片
切片脫水采用上行梯度酒精。濃度低的酒精比濃度高的酒精更容易脫水,但也容易使伊紅退色,故脫水時(shí)間要短(1~2min),也可無(wú)須用酒精脫水而直接晾干。切片經(jīng)二甲苯透明。用中性樹(shù)膠封片,一定要避免氣泡的產(chǎn)生。