1.   取100 µL新鮮的菌液接種到150-200 mL （勿超過(guò) 200 mL）的LB培養(yǎng)基（含適量抗生素），37^oC震蕩培養(yǎng)14-16小時(shí)。室溫下5,000 x g離心10分鐘，收集菌體，并盡可能的吸去上清。注：殘留的液體培養(yǎng)基容易導(dǎo)致菌液裂解不充分，離心后沉淀較松，不能有效吸取上清。注：本說(shuō)明書(shū)中的操作程序適用于標(biāo)準(zhǔn)LB （Luria Bertani）培養(yǎng)基培養(yǎng)12-16 小時(shí)后，OD₆₀₀（細(xì)菌密度）在2.0-3.0之間的菌液。若采用的是富集培養(yǎng)基，例如TB 或2×YT，請(qǐng)注意保證OD₆₀₀不超過(guò)3.0。

2.   加入10 mL Buffer A1（確保已加入RNase A），用移液器或渦流震蕩確保細(xì)菌沉淀重新懸浮。 注：不*懸浮易導(dǎo)致菌體裂解不*，從而使產(chǎn)量降低。

3.   加入 10 mL Buffer B1, 輕輕地反轉(zhuǎn)5-10 次以混合均勻，然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。  注：切勿劇烈振蕩。靜置時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致基因組DNA污染或質(zhì)粒受到破壞。若溶液未清亮澄清，則表明菌體裂解不充分，應(yīng)加大Buffer B1的用量或減少菌體量。

4.   加入3 mL Buffer N3, 立即反轉(zhuǎn)5次，用手用力搖晃3-5次充分混勻，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。

5.   將離心管轉(zhuǎn)至高速離心機(jī)，在室溫下12,000 x g離心10分鐘（若上清中有白色沉淀，可再次離心）。注：低溫下RNase不工作，易有RNA污染。如果離心機(jī)轉(zhuǎn)子較冷，將離心管在室溫下溫育10分鐘后再離心。若無(wú)告速離心機(jī)，可用Syringe filter替代（在PD1522中提供，也可單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)）。

6.   轉(zhuǎn)移上清液20 mL（不超過(guò)20 mL）至新的50mL離心管中，加入0.5倍體積的Buffer RET （即每20 mL裂解液加入10 mL Buffer RET） 及10 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混勻，需馬上離心過(guò)DNA柱。

7.   立即轉(zhuǎn)移20 mL裂解液/收集管至帶收集管的DNA柱中，室溫下> 2,500 x g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。將剩余溶液轉(zhuǎn)移至DNA柱中，室溫下> 2,500 x g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)直至所有的溶液通過(guò)DNA柱。注：如果50 mL的收集管與離心機(jī)轉(zhuǎn)子不符，可在臺(tái)式離心機(jī)> 2,500 x g 離心2分鐘。

8.   向離心柱中加入10 mL 70% 乙醇，室溫下> 2,500 x g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)步驟“9”。

9.將離心柱放回高速離心機(jī)中，室溫下5,000 x g開(kāi)蓋離心10分鐘，以*去除殘留的乙醇。注：此步驟中開(kāi)蓋離心將會(huì)更有效的去除殘留的乙醇，乙醇是否去除干凈將會(huì)影響zui后的洗脫效率。若轉(zhuǎn)速低于5,000 x g，需離心20分鐘，并可放在空氣中晾干。

10.將離心柱轉(zhuǎn)至一個(gè)新的50 mL離心管中，向DNA柱膜的正中加入1-1.5 mL 的Endofree Elution Buffer，室溫放置1分鐘，> 2,500 x g離心5分鐘，以洗脫質(zhì)粒DNA。將50 mL離心管中的洗脫液上柱再放置洗脫1分鐘，> 2,500 x g離心5分鐘。 兩次洗脫將提高得率。注：提取到的質(zhì)粒DNA可用于轉(zhuǎn)染內(nèi)毒素敏感性細(xì)胞株，原代細(xì)胞及用于微注射，建議去除內(nèi)毒素。

操作流程：