癌癥免疫學(xué)中的3D多標(biāo)記成像可更好地表征組織變化和細(xì)胞相互作用。本文介紹了一種在STELLARIS 共聚焦平臺(tái)上進(jìn)行3D成像的單次、超多標(biāo)工作流程，用于小鼠腫瘤組織成像。通過(guò)優(yōu)化成像設(shè)置和先進(jìn)的拆分技術(shù)，我們準(zhǔn)確地拆分了來(lái)自15種標(biāo)記物的信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞類型和功能狀態(tài)的精確識(shí)別。這種方法為癌癥研究提供了全面的工具，有助于深入理解腫瘤微環(huán)境。
在癌癥免疫學(xué)研究中，評(píng)估組織變化和細(xì)胞相互作用對(duì)于識(shí)別特定細(xì)胞類型、評(píng)估免疫細(xì)胞活化狀態(tài)、監(jiān)測(cè)特定蛋白質(zhì)和/或基因標(biāo)記物的表達(dá)以及表征腫瘤微環(huán)境至關(guān)重要。不同樣本之間的參數(shù)變化（例如健康與病變、治療與未治療）通常非常復(fù)雜，并且發(fā)生在三維環(huán)境中。
腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境的相互作用在很大程度上決定了某種類型癌癥的特征，因此成像策略是研究腫瘤組織的自然選擇。現(xiàn)代成像技術(shù)與多種組學(xué)方法的結(jié)合在空間生物學(xué)這一新興領(lǐng)域中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。來(lái)自基因組學(xué)、 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的信息，與結(jié)構(gòu)和空間-功能關(guān)系結(jié)合，可以提供其他方法難以獲得的洞見(jiàn)。
上述過(guò)程由分子和細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用驅(qū)動(dòng)。因此，使用熒光成像研究這些過(guò)程的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要能夠區(qū)分和定位大量標(biāo)記物，由抗體識(shí)別并與合適染料結(jié)合的靶抗原。
常見(jiàn)的成像一組標(biāo)記物的方法（即“面板"）包括每次最多4個(gè)標(biāo)記的依次染色/成像/去染步驟，隨后對(duì)圖像進(jìn)行校準(zhǔn)并重新定位樣品。
理論上，通過(guò)不斷迭代，可以成像無(wú)限數(shù)量的標(biāo)記物，然而在實(shí)際操作中，隨著多標(biāo)記數(shù)量的提高，這變得更加困難。此外，只有在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，即最后一次染色/成像/去染以及多圖像疊加完成后，才能看到所有標(biāo)記的結(jié)果。
這一點(diǎn)尤為關(guān)鍵，因?yàn)樵谌魏谓o定時(shí)刻只有少量標(biāo)記物可見(jiàn)。成像策略無(wú)法改變，如果出現(xiàn)意外或新的情況，也無(wú)法返回感興趣區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步探索或更改成像參數(shù)，因?yàn)闃悠芬呀?jīng)不再相同。
多圖像疊加增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，因?yàn)槊枯喅上穸夹枰粋€(gè)共同特征或標(biāo)記，作為基準(zhǔn)，使所有標(biāo)記能夠虛擬地組合在一起。一個(gè)廣泛使用的策略是在每次迭代中用 DAPI染色作為錨點(diǎn)，犧牲一個(gè)成像通道來(lái)進(jìn)行核染色。另一個(gè)限制在于染色/去染步驟的化學(xué)性操作，存在改變抗原和/或樣品物理完整性的風(fēng)險(xiǎn)，從而降低多標(biāo)記結(jié)果的質(zhì)量。最后，3D信息的重建并非經(jīng)典流程中的操作，由于樣品重定位和循環(huán)染色導(dǎo)致的變形，使得這一步變得極其困難。
單次成像方法提供了強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，可以克服超多標(biāo)應(yīng)用的一些挑戰(zhàn)。
由于所有多標(biāo)信息同時(shí)獲取，研究人員可以探索和調(diào)整成像策略，保護(hù)樣品免受嚴(yán)苛的去染處理，并直接在3D中獲得數(shù)據(jù)的結(jié)果，帶來(lái)額外維度的信息豐富性。
在此，我們通過(guò)對(duì)小鼠腫瘤組織進(jìn)行的單次3D 15標(biāo)（即15種標(biāo)記物）實(shí)驗(yàn)展示了這種方法的潛力（圖1a）。
圖1：?jiǎn)未纬鄻?biāo)工作流程。a, 3D 15標(biāo)成像實(shí)驗(yàn)概覽。該樣品（固定的小鼠腫瘤組織）使用單輪標(biāo)記方法對(duì)15種生物標(biāo)記物進(jìn)行染色，并在配備SpectraPlex功能的STELLARIS平臺(tái)上進(jìn)行3D圖像采集。內(nèi)置的高級(jí)拆分技術(shù)能夠準(zhǔn)確地分離每種標(biāo)記物的信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類型和功能狀態(tài)的后續(xù)識(shí)別。b, 本研究中使用的15標(biāo)面板，顯示了標(biāo)記物（染料-靶標(biāo)組合）及其染料發(fā)射光譜。
選擇15種標(biāo)記物使得科研工作者能夠?qū)υ摻M織中的一組免疫細(xì)胞、癌癥特征和結(jié)構(gòu)標(biāo)志物進(jìn)行功能描述。
樣品準(zhǔn)備過(guò)程中，將小鼠胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞（KPC-4662）皮下注射到C57Bl/6小鼠體內(nèi)，并允許其生長(zhǎng)3周。然后取出腫瘤，固定并制備厚度為70微米的切片并進(jìn)行染色。
我們選擇了一組目標(biāo)，以探討免疫腫瘤微環(huán)境：
T細(xì)胞（CD4, CD8）
B細(xì)胞（B220）
髓系細(xì)胞（包括樹突細(xì)胞）
T細(xì)胞的功能標(biāo)記（TCF1, FoxP3, PD1）
此外，實(shí)驗(yàn)還包括了結(jié)構(gòu)性和與癌癥相關(guān)的標(biāo)記物：
增殖標(biāo)記（Ki67）
基質(zhì)細(xì)胞（α-SMA, MHC I）
上皮細(xì)胞（E-鈣黏蛋白, MHC I）
細(xì)胞外基質(zhì)（Tenascin C）
內(nèi)皮細(xì)胞（CD31）（圖1b）
使用STELLARIS共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像，該顯微鏡配備了名為SpectraPlex的新功能，專門為超多標(biāo)成像方法提供一組工具。共聚焦功能不僅可以獲取薄組織切片的大視野圖像（如寬場(chǎng)的迭代成像方法），還可以在整個(gè)z范圍內(nèi)生成3D 圖像。高分辨率的3D數(shù)據(jù)支持空間分布模式的全面探索。
利用SpectraPlex，該15標(biāo)實(shí)驗(yàn)的步驟由“標(biāo)記面板"引導(dǎo)。這些標(biāo)記物通過(guò)在軟件中定義生物目標(biāo)和染料的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)，并可添加到一個(gè)名為“虛擬冰箱"的數(shù)據(jù)庫(kù)中。數(shù)據(jù)庫(kù)中存儲(chǔ)了實(shí)驗(yàn)室中常用或自創(chuàng)建的標(biāo)記物。
將相關(guān)的標(biāo)記物從虛擬冰箱中移動(dòng)到專用工具中，即可創(chuàng)建面板通過(guò)實(shí)時(shí)計(jì)算，面板為顯微鏡采集設(shè)置提供建議。這為儀器的后續(xù)交互操作提供實(shí)驗(yàn)控制的指導(dǎo)，而手動(dòng)優(yōu)化選項(xiàng)則為經(jīng)驗(yàn)豐富的用戶提供了靈活性。
在此示例中，基于先前經(jīng)驗(yàn)和商業(yè)染料設(shè)計(jì)確定了特定的目標(biāo)-染料組合。我們利用了整個(gè)激發(fā)光譜范圍 （405nm及440–790nm）和熒光發(fā)射光譜（高達(dá)850nm）（圖1b）。
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