光片顯微鏡（Light-Sheet Microscopy, LSM）是一種強(qiáng)大的三維成像技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究。本文將為您科普光片顯微鏡中的不同光片技術(shù)，重點(diǎn)介紹主瓣、光切片、長(zhǎng)度、分辨率、對(duì)比度和激光強(qiáng)度等關(guān)鍵性能指標(biāo)及其相互關(guān)系。
光片顯微鏡簡(jiǎn)介
光片顯微鏡通過(guò)在樣品上形成一層薄而均勻的光片來(lái)照明，從而獲得樣品的二維圖像。通過(guò)移動(dòng)樣品或光片，可以快速獲取整個(gè)三維樣本的圖像。這種方法不僅減少了光漂白和光毒性，還提高了成像速度和深度。
主瓣與光切片：光片的“心臟"與“軀體
在光片顯微鏡中，主瓣是指光片中強(qiáng)度最高的區(qū)域，它直接影響著顯微鏡的軸向分辨率。主瓣越薄，理論上分辨率越高。然而，光片的光切片，即整個(gè)光片的厚度，同樣對(duì)成像質(zhì)量有著決定性的影響。光切片不僅包括主瓣，還包括可能影響對(duì)比度的旁瓣或次要結(jié)構(gòu)。
在許多先前的出版物中，未能區(qū)分光片厚度和主瓣厚度可能會(huì)導(dǎo)致混淆，例如在提到“通過(guò)掃描貝塞爾光束產(chǎn)生的超薄平面照明"或“超薄貝塞爾光片"時(shí)，主瓣比相同長(zhǎng)度的傳統(tǒng)高斯光片更薄【19,25】。對(duì)于zui常用的具有高斯分布的光片來(lái)說(shuō)，只有一個(gè)光片，主瓣厚度和光片厚度的測(cè)量值嚴(yán)格成比例。但如圖1 所示，這對(duì)于具有輔助結(jié)構(gòu)（如側(cè)瓣或多條平行光片）的多瓣光束并不適用。
對(duì)于多瓣光束，當(dāng)僅考慮主瓣厚度時(shí)，樣品暴露的總照明功率中有相當(dāng)一部分被忽略。這種額外的曝光會(huì)在光片顯微鏡中貢獻(xiàn)到檢測(cè)到的熒光信號(hào)，從而可能降低圖像對(duì)比度。因此，考慮以下幾點(diǎn)非常重要：通常顯示的沿檢測(cè)軸的 PSF 切片可以用來(lái)推斷軸向分辨率。然而，它們使觀察者無(wú)法計(jì)光學(xué)分層性能或光片厚度。
圖 1. 不同光束形狀對(duì)光片顯微鏡中軸向分辨率 dz 和光學(xué)切片 OS 影響的示意圖。
照明點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF，藍(lán)色）表示照明光的強(qiáng)度。
檢測(cè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF，綠色）表示熒光光子的位置依賴性檢測(cè)概率。
虛線表示等強(qiáng)度表面，例如，峰值的 37%。
虛紅線表示結(jié)合照明和檢測(cè) PSF 的等表面（照明強(qiáng)度和檢測(cè)概率的乘積）。它沿檢測(cè)軸的范圍與系統(tǒng)的軸向分辨率成比例。
綠色陰影區(qū)域表示熒光分子被照明并收集熒光的體積。光學(xué)切片測(cè)量該體積沿檢測(cè)軸的范圍。
在 a) 中，顯示了單瓣照明光束，分辨率是各向異性的，即橫向分辨率優(yōu)于軸向分辨率，但光學(xué)切片接近軸向分辨率。
在 b) 中，顯示了多瓣照明光束，分辨率是各向同性的，但從旁瓣照明區(qū)域收集到額外的熒光信號(hào)。光學(xué)切片劣于軸向分辨率。旁瓣照亮離焦平面，使圖像模糊。
光片長(zhǎng)度：決定視野的關(guān)鍵
光片的長(zhǎng)度是另一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，它決定了可以均勻照明的樣本區(qū)域大小。較長(zhǎng)的光片可以覆蓋更大的視野，但可能會(huì)犧牲一些分辨率。
分辨率與對(duì)比度：成像質(zhì)量的雙重奏
分辨率是衡量顯微鏡性能的基石，它決定了我們能看到的最小細(xì)節(jié)。而對(duì)比度則是圖像中亮區(qū)與暗區(qū)的差異，高對(duì)比度意味著更清晰的圖像細(xì)節(jié)。在光片顯微鏡中，主瓣的厚度和光切片的均勻性共同決定了分辨率和對(duì)比度：
軸向分辨率取決于顯微鏡點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）沿檢測(cè)軸的分布寬度
圖像對(duì)比度取決于光片的整體厚度
激光強(qiáng)度：照亮微觀世界的光源
激光強(qiáng)度是生成光片的基礎(chǔ)。不同強(qiáng)度的激光可以產(chǎn)生不同特性的光片。例如，高強(qiáng)度激光可以生成更薄的主瓣，但也可能增加樣品的光漂白和光毒性。
圖 2. 主峰厚度和光學(xué)分層的定義。展示了單峰光束 (a) 和多峰光束 (b) 的強(qiáng)度在 yz 方向上的橫截面。在焦點(diǎn)處 (紫色線) 和距離 y = L 處 (厚度加倍的地方, 藍(lán)色線) 的相應(yīng)剖面顯示在 c-j 中。c, d 和 e, f 分別說(shuō)明了單峰光束 (c, d) 和多峰光束 (e, f) 的主峰厚度，定義為在焦點(diǎn)處強(qiáng)度高于最大強(qiáng)度 37% 的范圍，分別在焦點(diǎn)處 (c, e) 和距離 y = L 處 (d, f)。子圖 g-j 相應(yīng)地說(shuō)明了光學(xué)切片厚度 wOS ，定義為包含光束功率 63% 的范圍。
觀察由掃描光束形成的光片時(shí)，相關(guān)的測(cè)量包括：
在檢測(cè)軸上強(qiáng)度shou次下降到峰值強(qiáng)度的一部分的距離
在距離檢測(cè)焦平面一定距離內(nèi)由光片產(chǎn)生的總熒光量
第一個(gè)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)提供軸向分辨率，而第二個(gè)提供對(duì)比度。軸向分辨率是沿檢測(cè) z 軸可以分辨出兩個(gè)物體的最小距離。對(duì)比度是聚焦特征信號(hào)與背景信號(hào)（主要來(lái)自失焦特征）的差異。圖 2a 顯示了由單峰光束形成的光片的示例。圖 2c 和 2d 顯示了在光束傳播軸上兩個(gè)位置處以 1/e=37% 峰值強(qiáng)度測(cè)量的分布寬度，圖 2g 和 2h 顯示了標(biāo)記光束總能量 63% 的積分輪廓。在強(qiáng)度大于峰值強(qiáng)度 37% 的范圍內(nèi)，高斯強(qiáng)度分布的光片攜帶其總能量的 84%。原因在于光片不是一個(gè)圓對(duì)稱光束，而是主要沿檢測(cè)軸向一個(gè)方向擴(kuò)展。
在比較不同光片時(shí)，第一個(gè)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)（強(qiáng)度下降）與第二個(gè)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)（區(qū)域內(nèi)包含的能量）之間的比例與任何長(zhǎng)度的單峰光片的比例數(shù)值無(wú)關(guān)。
對(duì)于多峰光片來(lái)說(shuō)，第一個(gè)和第二個(gè)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)得到的值可能會(huì)有顯著差異，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。如圖 2 右側(cè)所示，強(qiáng)度分布降到峰值的 1/e 的距離僅反映了主峰的厚度（圖 2e, f）。因此，作者引入了“主峰厚度"這個(gè)術(shù)語(yǔ)來(lái)表示這個(gè)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。圖 2i, j 中標(biāo)示的光學(xué)分層 wOS 考慮到主峰可能不具備足夠的能量來(lái)貢獻(xiàn)總檢測(cè)信號(hào)的 63%。
這一測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)給出的值明顯大于主峰厚度，更接近反映了光片的真實(shí)厚度。
性能間的關(guān)系：協(xié)同與權(quán)衡
在實(shí)際應(yīng)用中，這些性能參數(shù)之間存在著協(xié)同與權(quán)衡。例如，追求更薄的主瓣以提高分辨率可能需要犧牲一些光切片的均勻性，從而影響對(duì)比度。同樣，增加激光強(qiáng)度以改善信噪比，也可能帶來(lái)光漂白的風(fēng)險(xiǎn)。
不同光片技術(shù)的原理與應(yīng)用
1. 高斯光片
最常見的光片類型，以其簡(jiǎn)單的高斯強(qiáng)度分布而著稱。適用于需要均勻照明的大視場(chǎng)成像。
2. 聚焦平坦頂光片
在焦點(diǎn)處提供均勻的照明，但邊緣有較弱的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，適用于需要高對(duì)比度的成像。
3. 貝塞爾光片
具有自我重建的特性，即使在復(fù)雜介質(zhì)中也能保持形狀不變，適用于需要高分辨率的成像。
4. 艾里光片
通過(guò)特定的相位調(diào)制產(chǎn)生，具有在特定方向上傳播的特性，適用于需要高對(duì)比度和高分辨率的成像。
5. 雙光束光片
通過(guò)兩個(gè)子光束的干涉產(chǎn)生，形成一系列光片，適用于深層樣品成像。
圖2. 各種光束類型相對(duì)于高斯光束的光學(xué)分層（藍(lán)色）和主瓣厚度（橙色）的比率。所有值均為光束長(zhǎng)度 L 約為 30 µm 計(jì)算得出。插圖顯示了解釋圖表的方案。值大于 100% 表示主瓣或光學(xué)分層比高斯光束更厚。
對(duì)于所有類型的光片顯微鏡，光學(xué)切片和軸向分辨率取決于光片的長(zhǎng)度。因此，僅在長(zhǎng)度相等的情況下比較光片特性是至關(guān)重要的。在大多數(shù)情況下，長(zhǎng)度是由樣品或研究人員希望在單幀中觀察的視野決定的。
因此，作者選擇首先定義光片長(zhǎng)度的方法，然后根據(jù)它們提供的軸向分辨率和光學(xué)切片來(lái)比較光片。
將高斯光束設(shè)為參考值，作者計(jì)算了相同光束長(zhǎng)度下不同光束類型在厚度和光學(xué)切片方面的相對(duì)增益或損失。
圖2顯示了長(zhǎng)度為30?µm的光片的結(jié)果。數(shù)值超過(guò)100%表明光片厚度 wOS 或主瓣寬度wML大于高斯光束。
總體而言，作者發(fā)現(xiàn)對(duì)于所有光束類型，在這兩個(gè)特性之間存在權(quán)衡：制造薄光片會(huì)以高斯光束的長(zhǎng)度或其他光片類型的光學(xué)切片為代價(jià)。
光片顯微鏡的技術(shù)選擇是一個(gè)綜合考量的過(guò)程，需要在分辨率、對(duì)比度、光切片質(zhì)量和激光強(qiáng)度之間找到最佳的平衡點(diǎn)。通過(guò)深入理解這些技術(shù)參數(shù)及其相互關(guān)系，您可以更加自信地選擇和優(yōu)化適合自己研究的光片顯微鏡技術(shù)。
光片模擬軟件軟件
作者的光片模擬器應(yīng)用程序*數(shù)值計(jì)算光片的 3D 強(qiáng)度分布并量化其尺寸。它可以生成高斯光束、聚焦平頂光束、艾里光束、貝塞爾光束、貝塞爾光束晶格、雙光束和球差光束，以及用戶引入的任意類型光片。該算法將光束在后焦平面的電場(chǎng)幅度和相位作為初始條件，使用光束傳播方法計(jì)算其在焦平面周圍的傳播。
* E. Remacha “Light Sheet Simulator" (2019) [retrieved 5 November 2019]
操作步驟
在Matlab環(huán)境中運(yùn)行LightSheet_Simulator.mlapp，圖3顯示了GUI示例。有三種可能的操作：
仿 真
允許可視化光片的截面以及后焦平面的強(qiáng)度和相位。要模擬本文討論的光片，請(qǐng)?jiān)谶x項(xiàng)卡面板中選擇光束類型并輸入所需參數(shù)。要模擬自定義光片，請(qǐng)選擇“創(chuàng)建光片"選項(xiàng)卡。輸入包含后焦平面幅度和相位的文件路徑。這些文件必須以 tiff 格式提供。
分 析
在模擬光片后，按“分析"以獲得本文定義的主瓣寬度wML、光學(xué)切片厚度 wOS 和長(zhǎng)度L 的值。
保 存
在zhi定的目錄下創(chuàng)建文件 simulated_lightsheet.m。該文件包含 3D 強(qiáng)度矩陣以及計(jì)算中使用的數(shù)值和物理參數(shù)。
圖3. 光束模擬器用戶界面
圖3展示了光束模擬器的用戶界面，通過(guò)這個(gè)界面，用戶可以選擇不同類型的光束進(jìn)行仿真，分析結(jié)果，并保存數(shù)據(jù)。
閱讀原文：
Elena Remacha, Lars Friedrich, Julien Vermot, and Florian O. Fahrbach, "How to define and optimize axial resolution in light-sheet microscopy: a simulation-based approach," Biomed. Opt. Express 11, 8-26 (2020)
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