開發(fā)用于生命科學(xué)應(yīng)用的多波長落射或入射照明熒光顯微鏡和反射對比顯微鏡。
多年來，熒光顯微鏡一直僅使用透射光和暗場照明。隨著時間的推移，對改進照明的需求不斷增長，這導(dǎo)致了落射照明（也稱為入射光照明）的發(fā)展。經(jīng)過 40 年的發(fā)展和改進，落射照明熒光顯微鏡已成為生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)診斷和材料科學(xué)領(lǐng)域常規(guī)實驗室工作和研究的實用方法。大部分開發(fā)工作由 Ploem 集團和 Leitz 公司（現(xiàn)為 Leica Microsystems）完成。
熒光和顯微鏡
熒光既可以是生物和無機結(jié)構(gòu)的自發(fā)熒光，也可以是用特殊染料（熒光染料、熒光標記）處理標本后產(chǎn)生的所謂二次熒光 [1-3]。要在顯微鏡中進行熒光成像，必須滿足以下要求：強光源（LED 或氣弧燈）、用于準確選擇激發(fā)和發(fā)射光的適當(dāng)透射濾光系統(tǒng)，以及適合的熒光成像的光學(xué)部件，即聚光鏡、照明部件、分光鏡、物鏡、鏡筒透鏡、目鏡和照相機 [4]。使用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)可以進行多光子熒光顯微鏡觀察，使用比發(fā)射光波長更長的 2 個或更多光子進行激發(fā)[5]。
與今天相比，熒光顯微鏡的shouci應(yīng)用是在透射光和暗視野顯微鏡的基礎(chǔ)上進行的，這是因為當(dāng)時熒光顯微鏡的應(yīng)用范圍有限。但是，隨著熒光顯微鏡在組織學(xué)、細胞學(xué)、分子生物學(xué)和免疫診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用日益重要，人們越來越需要從根本上改進照明和觀察技術(shù)。這一需求催生了落射光顯微鏡或入射光熒光顯微鏡的誕生 [6]。
經(jīng)過近 40 年的發(fā)展和改進，這項技術(shù)已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域常規(guī)和研究工作的基本工具之一。入射光熒光顯微技術(shù)的進步主要得益于 Ploem 小組的研究工作及其yinlin潮流的作用，同時也得益于 Leitz（現(xiàn)為 Leica Microsystems）在開發(fā)所需光學(xué)儀器方面的前瞻性戰(zhàn)略。
本文將介紹這一發(fā)展歷程。
落射光熒光顯微鏡的早期發(fā)展
關(guān)于熒光顯微鏡的歷史回顧，讀者可參閱 Kasten [7]。Policard 和 Paillot [8] 早已使用落射（垂直入射激發(fā)光）。Leitz （現(xiàn)為 Leica Microsystems）、Bausch & Lomb、Reichert 和 Zeiss 制造了一些儀器，這些儀器部分是根據(jù) Ellinger 和 Hirt [9,10]、Singer [11] 以及 Mehler 和 Pick [12,13] 的建議制造的。Haitinger [14] 描述了早期的徠茲熒光落射照明系統(tǒng)。關(guān)于落射熒光顯微鏡發(fā)展的更多細節(jié)，讀者可參閱 Rost [15]，關(guān)于入射光熒光顯微鏡的早期應(yīng)用，可參閱 Hauser [16]。
Brumberg 和 Krylova [17]對落射照明熒光顯微鏡的一大貢獻是引入了二色分光鏡（簡稱：二向色鏡），用于紫外線（UV）入射照明。落射具有明顯的光學(xué)優(yōu)勢。透射照明的聚光器和物鏡具有獨立的光軸，必須wanquan對準，而落射照明則不同，物鏡既是聚光器，又是集光物鏡，避免了所有對準問題。與透射熒光顯微鏡相比，使用二向色鏡將熒光發(fā)射與激發(fā)光分離要容易得多。而研發(fā)人員缺乏興趣的主要原因可能是透射光暗場紫外激發(fā)在大多數(shù)熒光顯微鏡應(yīng)用中已經(jīng)取得了jijia的效果[18]。用紫外落射激發(fā)取代它不會帶來明顯的優(yōu)勢。直到 60 年代末，使用暗視野聚光器的透射光仍是行業(yè)標準。
然而，隨著人們對分子生物學(xué)的興趣迅速增長，許多用于檢測細胞中重要大分子的單克隆抗體也應(yīng)運而生。為了研究細胞器中幾種大分子的詳細形態(tài)位置，人們越來越多地使用不同顏色的熒光標記。傳統(tǒng)上用于熒光顯微鏡的紫外線激發(fā)并不適合同時檢測細胞中的多種熒光色素。
1962 年左右，Ploem 開始與肖特公司合作開發(fā)二向色光束發(fā)射器，用于反射藍光和綠光，利用落射照明進行熒光顯微鏡觀察。在 1965 年發(fā)表第一篇關(guān)于使用窄帶藍光和綠光進行落射照明的文章[19]時，他還不知道 Brumberg 和 Krylova [20] 開發(fā)出了用于入射光紫外激發(fā)的二向色鏡。徠茲公司也不知道，他從該公司獲得了一個帶有中性分光鏡的"Opak"落射照明部件。他必須對這種照明部件進行改裝，以便在入射光路徑上安裝一個滑塊，滑塊上有四個二向色鏡，分別用于紫外線、紫光、藍光和綠光的激發(fā)。這種裝置由阿姆斯特丹大學(xué)開發(fā)，可以方便地在入射光路中更換不同的二向色鏡（圖 1a）。激發(fā)光的波長可以輕松快速地改變。
圖 1：a) 熒光多波長落射光源，四個二向色鏡安裝在滑塊中，用于紫外、紫光、藍光和綠光激發(fā)光的入射照明。b) Leitz 多波長落射光源原型（未商業(yè)化），帶有四個安裝在滑塊中的二向色鏡[20]。
很快，人們發(fā)現(xiàn)使用窄波段藍光和綠光激發(fā)為檢測廣泛使用的免疫熒光標記--異硫氰酸熒光素（FITC）和異硫氰酸四甲基羅丹明（TRITC）提供了最佳可能性。使用藍光和綠光激發(fā)還能最大限度地減少組織成分的自發(fā)熒光，這是傳統(tǒng)的紫外線透射照明達不到的效果?，F(xiàn)在，F(xiàn)ITC 可以使用窄帶藍光（使用半寬為 16 納米的帶干擾濾光片）激發(fā)，接近 490 納米（長藍波長）的激發(fā)最大值，并能清楚地觀察到 520 納米的綠色熒光發(fā)射峰。組織成分的自發(fā)熒光被降至zui低（圖 2a 和 b），從而獲得高對比度。
圖 2：a) 用 FITC 對組織細胞進行免疫標記，并用寬波段紫外線激發(fā)光照射。b) 與 2a 相同的組織和免疫印跡，使用窄波段藍光（490 納米）進行落射照明。注意圖像對比度的增加 [19]。
將 FITC 激發(fā)至其激發(fā)最大值附近可實現(xiàn)高效激發(fā)，甚至可以使用在藍色波長范圍內(nèi)沒有強發(fā)射峰的汞燈。此外，使用綠色反射二色鏡進行落射照明，還shouci實現(xiàn)了用 546 納米的強汞發(fā)射線激發(fā) Feulgen-pararosaniline （圖 3a 和 b）。
圖 3：a) 肝組織。用 Feulgen-parosanilin 對 DNA 進行染色，并用透射綠光觀察細胞核。這種染色劑被稱為吸收性染色劑，不具有熒光性。用窄帶綠光（546 納米）照射其中一個細胞核，產(chǎn)生紅色熒光。使用窄波段綠光（546 納米）和反射綠光的二向色鏡進行落射。這可能是第一個用綠光激發(fā)顯微鏡的例子[19]。注意圖像對比度大。
在描述帶有四個二分束片的徠茲（Leitz）原型多波長落射照明部件的第二篇文章中（圖1b），Ploem [20]承認了Brumberg和Krylova [17]的貢獻。由于當(dāng)時俄羅斯的研究還處于起步階段，而且俄羅斯或東德在落射熒光顯微鏡方面還沒有任何重大的工業(yè)發(fā)展，因此徠茲公司早先并沒有意識到這一發(fā)展。采用紫外光進行落射照明的可能性雖然在一些應(yīng)用中非常有用，但并不是徠茲公司進行新技術(shù)開發(fā)的動機，因為他們已經(jīng)有了出色的透射暗場紫外光激發(fā)技術(shù)。然而，隨著全球范圍內(nèi)常規(guī)免疫熒光顯微鏡在醫(yī)療診斷和分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用日益廣泛，使用藍光和綠光窄帶激發(fā)的新型落射照明技術(shù)也將從中受益標準的高壓汞弧燈的使用讓其成為了一個切實可行的提案。
隨后，Leitz 開發(fā)出一種新型的多波長熒光落射照明部件（PLOEMOPAK），帶有四個可旋轉(zhuǎn)的二向色分光鏡，分別用于紫外光、紫外光、藍光和綠光[22]。在連續(xù)幾代徠茲照明部件（包含四個二向色鏡）中，又增加了阻隔濾光器和用于激發(fā)片的旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)塔。最后，卡夫（Kraft）[21] 設(shè)計了一種優(yōu)雅的落射照明部件，包含多組激發(fā)濾光片、二色分光鏡、阻擋濾光片或發(fā)射濾光片，安裝在一個濾光片立方體或濾光片塊中（圖 4）。
圖 4：用于熒光顯微鏡的完整徠茲濾光塊，包含激發(fā)濾光片、二向色鏡和發(fā)射（屏障）濾光片。
由于這種照明部件可將濾光塊快速轉(zhuǎn)入光路，因此對同一組織切片進行多波長照明成為現(xiàn)實。此外，用戶還可以更換照明部件中的四個濾光塊（圖 1c）。用戶可以從許多濾光塊中選擇不同的四組濾光塊進行組裝，這些濾光塊包含激發(fā)片、發(fā)射片和二向色鏡的組合，是為不同應(yīng)用而開發(fā)的。根據(jù) Ploem 的建議，Leitz 還生產(chǎn)了一種帶落射照明的倒置顯微鏡（圖 5a 和 b）。有關(guān)用于多波長熒光顯微鏡的 PLOEMOPAK 照明部件的綜述，請參閱 Pluta [23] 的綜述。
圖 5：a) 帶有多波長落射照明部件的徠卡倒置熒光顯微鏡。b) 在移植研究中，用裝有落射照明部件的倒置顯微鏡對在Terasaki®塑料皿中的人類淋巴細胞的熒光細胞毒性檢測試驗進行成像。c) 8濾光塊的Leitz電動落射照明部件。
Leitz濾光塊系統(tǒng)非常高效，即使在今天，大多數(shù)顯微鏡制造商仍將類似類型的濾光塊用于多波長熒光顯微鏡。這一發(fā)展最終促成了自動多波長熒光落射照明部件的開發(fā)，它可容納八個濾光塊，用于不同的波長范圍（圖 5c）。在濾光塊之間切換時，由于采用了 0 像素位移技術(shù)，電腦顯示器上的像素位移得以避免，或保持在 35 毫米膠片的分辨力以下。這種照明部件還可用于研究染色體的熒光原位雜交方法（FISH）。
Ploem [24,25,26,27,28]、van der Ploeg 和 Ploem [29] 以及 Nairn 和 Ploem [30]進一步探索了許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用必須開發(fā)的濾光片組合。這是 Schott 和 Leitz 合作完成的。Rygaard 和 Olson [31] 開發(fā)了一種新型短波通高透射干擾濾光片，對藍光具有ji高的透射率，對波長長于 490 nm 的波長具有敏銳的過濾功能。
Ploem [32]將這種短波通（SP）濾光片與肖特（Schott）公司生產(chǎn)的 1 毫米 Y（黃色）455 濾光片結(jié)合使用，后者可以阻擋紫外線的激發(fā)，并建議 Balzers 公司開發(fā)一種類似的濾光片（SP 560），用于綠光激發(fā)，另一種濾光片（長波通（LP）425）用于紫光激發(fā)。后一種濾光片被應(yīng)用于神經(jīng)遞質(zhì)的研究[25]。在圖 6a 和 b 中可以觀察到由此產(chǎn)生的藍色熒光。
圖 6：a) 大鼠腸系膜，小血管周圍有藍色熒光腎上腺素能（CA）神經(jīng)叢和黃色熒光肥大細胞（5-HT）。b) 與 6a 相同的組織和染色，采用落射照明和窄帶紫光激發(fā)光（LP 3 mm、Y 400 和 SP 425 干涉濾光片），495 nm 的二向色鏡反射紫光，以及 LP 460 nm 的屏障濾光片。這個濾光塊shou次觀察到了藍色熒光腎上腺素能神經(jīng)纖維，與黃色熒光肥大細胞截然不同[25]。
在光學(xué)行業(yè)方面，Kraft [33]、Walter [34,35]、Trapp [36]、和Herzog [37]等人撰寫了有關(guān)這些發(fā)展的早期文章和評論。
用于落射熒光顯微鏡的濾光片主要分為兩類：(a) 主激發(fā)濾光片 LP（長通）和 SP（短通）（在德國文獻中稱為 KP 濾光片）；(b) 次級濾光片，如屏障濾光片和發(fā)射濾光片[32]。后者也被稱為熒光選擇濾光片，例如用于限制 FITC 在 520 納米波長處的熒光峰值。Reichman [38]對熒光顯微鏡用濾光片進行了廣泛的綜述。
Cormane[39]shouci證明，在人類皮膚病的免疫熒光研究中，熒光標簽 FITC 的窄帶藍光落射照射可產(chǎn)生zuijia對比度。過去，用紫外線透射光激發(fā)皮膚中的彈性纖維會產(chǎn)生強烈的自發(fā)熒光，從而嚴重阻礙了熒光抗體的觀察。
70 年代，隨著免疫熒光和其他分子生物學(xué)方法（如 FISH）在醫(yī)學(xué)診斷和研究中的應(yīng)用在全球范圍內(nèi)不斷增加，徠茲在落射照明熒光顯微鏡方面的開創(chuàng)性工作也應(yīng)運而生。Hijmans 等人[40.41]shouxian證明了新型多波長激發(fā)外發(fā)光器的實用性，他們使用與綠色熒光染色劑 FITC 和紅色熒光染色劑 TRITC 的抗體，選擇性地檢測細胞中某些類別的免疫球蛋白。他們采用藍光和綠光雙波長激發(fā)法，并通過 520 納米的發(fā)射濾光片選擇 FITC 的熒光峰值（圖 7）。Brandtzaeg [42] 和 Klein 等人[43]在使用 Leitz 落射部件的雙波長激發(fā)法鑒定免疫學(xué)上重要的細胞類型時也有類似的發(fā)現(xiàn)。在"花環(huán)"形成的血液染色中，使用紫外光和綠光的雙波長激發(fā)法可以顯示單核細胞周圍的紅細胞（圖 8）。
圖 7：用抗 kappa TRITC 結(jié)合物和抗 IgG FITC 結(jié)合物對骨髓細胞進行染色。用窄波段綠光和藍光外顯，含有 TRITC 的細胞發(fā)出紅色熒光，含有 FITC 的細胞發(fā)出綠色熒光。有些細胞同時含有 FITC 和 TRITC。
圖 8： "蓮座狀 "的人類血細胞。用紫外光落射照射用藍色熒光染料石炭酸染色的紅細胞。曙紅染色的淋巴細胞經(jīng)綠光激發(fā)后用發(fā)射出橘紅色的熒光[19]。
落射照明
在落射照明中，使用二向色鏡將入射光偏轉(zhuǎn)到樣本上。二向色鏡的光譜特性是這樣設(shè)計的：只有所需的激發(fā)波長才能通過物鏡向下偏轉(zhuǎn)到樣本上，而不需要的波長則會被二向色鏡透射并收集到二向色鏡后面的光阱中[21]。消除這些不需要的激發(fā)光可顯著減少雜散光，從而提高圖像對比度。二色鏡可將所需的（短波長）激發(fā)光通過物鏡偏轉(zhuǎn)到樣本上，但對較長的熒光波長是透明的。抑制濾光片（屏障濾光片）可吸收（或反射）從標本和物鏡透鏡表面反射的激發(fā)光，但對熒光高度透明，熒光隨后可到達目鏡或相機傳感器。落射照明的效率與物鏡數(shù)值孔徑（NA）的四次方有關(guān)，物鏡首先用作聚光器，然后作為聚光鏡用于觀察。在第一臺多波長落射照明設(shè)備上市時，只有高 NA（0.95、1.30）的高倍率物鏡（70x、100x）可供選擇。根據(jù) Ploem [19,20]的建議，Leitz 成為diyi家生產(chǎn)中等功率物鏡的制造商，如 NA 為 1.30 的油浸 40x 物鏡（圖 9）。這種新型物鏡專為落射照明熒光顯微鏡而設(shè)計，可產(chǎn)生非常明亮的圖像，從而縮短了常規(guī)熒光顯微攝影的曝光時間。
圖 9：早期的 Leitz 40x 油浸物鏡原型（"Versuchs"），NA 值為 1.30，用于熒光落射照明技術(shù)的試驗[20]。
物鏡入瞳孔（孔徑）的優(yōu)化填充
落射熒光顯微鏡的一個問題是如何以最佳方式使光源圖像充滿物鏡的入口瞳孔。典型的光源中等放大倍率約為 8 倍。這一結(jié)果與各種高壓汞燈和氙弧燈的電弧大小不同有關(guān)。此外，物鏡的入口瞳孔也有很大差異，例如 100 倍、NA 0.90 的物鏡入口瞳孔為 3.6 毫米，而 10 倍、NA 0.30 的物鏡入口瞳孔為 12 毫米。此外，如果只有部分弧光能進入入口瞳孔，所獲得的熒光強度就會減弱。Sch?nenborn [44] 報告了 DMR（HCS）顯微鏡中創(chuàng)新的入射光的路徑。現(xiàn)在，落射光路的設(shè)計允許根據(jù)不同應(yīng)用的特定光源對光路徑進行單獨調(diào)整。假定在入射光光路中使用科勒照明，則需要將照明光學(xué)部件和聚光鏡組合起來，以便在物鏡的入射孔中對光源成像。對于特定物鏡，光源放大倍率的選擇直接取決于其幾何尺寸。鹵素?zé)舻恼{(diào)節(jié)應(yīng)該非常精確，因為燈絲的線圈對于燈絲調(diào)整的不準確非常敏感。因此建議使用相對較低的放大倍率。
徠卡顯微系統(tǒng)公司進一步改進了熒光顯微鏡的物鏡。選擇自發(fā)熒光特性低的光學(xué)玻璃可提高圖像對比度。
寬場照明熒光顯微鏡的一個問題是，相對較厚的標本無法獲得清晰的圖像。造成這種結(jié)果的原因是，在使用高數(shù)值孔徑物鏡時，相鄰光學(xué)平面的散射光會對最終顯微鏡圖像造成不必要的失焦。不過，徠卡共聚焦顯微鏡可以利用光片技術(shù)，從樣本內(nèi)的一個或多個焦平面獲得高橫向和縱向分辨率的清晰圖像。
光譜拆分進一步提高了樣本中多種熒光染料的顏色分離效果。在生物醫(yī)學(xué)和材料研究領(lǐng)域，計算機輔助光譜共聚焦掃描顯微鏡已成為熒光顯微鏡的強大工具。最近，一種名為 Mica 的成像系統(tǒng)問世。它統(tǒng)一了多種熒光成像模式，包括寬場、共焦、Thunder、LIGHTNING、多重標記等。
用于分子生物學(xué)各種應(yīng)用的濾光塊
在過去的十年中，分子生物學(xué)的應(yīng)用急劇增加，因此開發(fā)出了許多適用于各種應(yīng)用的濾光片組合，其被安裝在各種濾光塊支架中。熒光落射照明可通過手動或電動方式切換2至8個濾光塊。在此不對各種濾光快的多種應(yīng)用進行全面詳細的討論。
抗反射-對比顯微鏡 (RCM)
徠茲公司開發(fā)的落射光顯微鏡還帶來了進一步的發(fā)展：反射-對比顯微鏡（RCM）[45,46]。反射-對比顯微鏡可從過氧化物酶-DAB、免疫金銀和免疫磷酸酶等常規(guī)標記物染色的標本中獲得強信號（圖10和11）。由于強信號增強了圖像對比度，且圖像質(zhì)量不會因前后焦點的偏移而變差， RCM 可以用來觀察超薄的樣品并可獲得高清的圖像。
圖 10：使用反射-對比顯微鏡（RCM）觀察和拍攝的附著在載玻片上的被單克隆抗體標記的小鼠腹腔巨噬細胞。單克隆抗體對該樣本的表面抗原進行了標記，然后使用了免疫過氧化物酶染色。由于DABox染料的強反射，可以看到在普通顯微鏡下無法觀察到的細胞突起的細長部分。
圖 11：用過氧化物酶 DAB 染色法制備的腎組織超薄切片（約 35 納米厚）。與熒光顯微鏡相比，用反射對比顯微鏡觀察腎小球的線性染色模式能獲得更清晰的圖像。
電子顯微鏡（EM）中使用的大多數(shù)免疫染色物質(zhì)的強反射提供了如此高對比度，以至于這種染色可以與許多經(jīng)典的（吸收性的）組織化學(xué)染色物質(zhì)結(jié)合在一起，用于顯示適度強反射的重要大分子。后者的染色通常用于增強細微的形態(tài)定位，并且在許多情況下，比僅使用熒光標記物更精確地確定了免疫標記物的位置。此外，這樣的光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果可以通過使用具有相同免疫染色的下一個超薄切片進行電子顯微鏡檢查來進行確認。
圖 12：用于反射對比顯微鏡的濾光塊包含一個偏振鏡、一個中性（50%）分光鏡和一個分析器。該濾光塊可插入 Leica 熒光顯微鏡中落射照明部件的一個位置。
通過共聚焦激光掃描顯微技術(shù)，可以在不需要特殊物鏡或其他減少雜散光光學(xué)措施的情況下執(zhí)行反射式對比顯微（RCM），得益于通過小孔照明消除雜散光的效果。大多數(shù)具有吸收特性的免疫染色劑對激光有著非常強的反射作用，并且其褪色現(xiàn)象極為有限。這些染色劑常允許采用更小的小孔尺寸（例如，10微米），此尺寸比在共聚焦熒光激光掃描顯微中使用的大多數(shù)熒光染料所能接受的小孔尺寸?。槠湮宸种坏绞种唬Ｒ虼?，反射型免疫標記的使用可顯著提高光學(xué)分辨率。使用熒光染料雙重染色并通過Leica共聚焦激光掃描顯微鏡成像的樣本，提供了同時檢測多個標記物和一個反射型免疫標記物的可能性。
RCM 使用熒光顯微鏡架、落射照明部件和高強度光源（如氣體弧光燈）。在熒光落射照明部件中，必須插入一個額外的偏振濾光塊，其包含偏振片、反射器和分析器（圖 12）。此外，還必須將反射對比（RC）光闌模塊（包含中央光闌系統(tǒng)）置于入射光路徑中。該RC光闌模塊適配具有中央光闌和/或孔徑光闌的滑動組。此外，應(yīng)該將專門為反射對比顯微鏡開發(fā)的特殊目鏡添加到顯微鏡目鏡套裝中。
反射光顯微鏡的對比度基于反射強度（反射率）的差異。對于這種顯微鏡，光的反射發(fā)生在每一個光學(xué)邊界，即當(dāng)折射率和/或吸收率發(fā)生變化時。對于反射率小于 1%（大部分小于 0.2%）的生物標本，由于顯微鏡管內(nèi)存在不必要的反射，因此使用傳統(tǒng)顯微鏡幾乎不可能獲得反射光圖像。 第一種方法是在入射光路徑上與物鏡后焦平面（孔徑）相接的平面上插入中心擋片（帶有中心擋片的光圈光闌，形成環(huán)形孔徑），使入射光成為環(huán)形光錐。第二種方法是使用“防反射"方法減少不必要的散射光或反射光。通過使用交叉偏振片來抑制顯微鏡內(nèi)部的反射光，從而使只有從標本反射的光才能傳遞到目鏡或相機傳感器。因此，物鏡的前透鏡上裝有四分之一波板。光線通過四分之一波板時（向下到達樣本，從樣本反射后向上），光線的偏振方向會改變?yōu)?2 x 45° = 90°。
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