活細胞無時不在與外界進行著物質和能量的交換，其代謝水平應是其生命體征的主要表現。在健康和疾病中，代謝程序和它們所支持的特定生理功能之間有著密切的聯系。這些核心代謝功能的失調與許多現代疾病有關。由于每個細胞都生活在一個du特的環(huán)境中，我們體內沒有一個細胞在新陳代謝、表型和功能上wan全相同。在單細胞分辨率下，解決代謝的時空異質性將推動代謝領域向前發(fā)展，并轉換到臨床應用和理解體內系統(tǒng)代謝組學變化的基礎。
相比DNA和RNA，細胞內的代謝物無法擴增，單個細胞能夠提供的用于分析的代謝物濃度低體積小，對分析設備和方法的要求較高。因此，本次研究將具有單細胞取樣精度的激光顯微切割 (LMD, Laser Microdissection)技術和SCIEX 7500高靈敏度質譜系統(tǒng)聯合使用，測試在能夠用于有效分析的細胞數量。
實驗設計
樣品制備：
腦組織做冰凍切片，樣本置于激光顯微切割載物臺；接收端放置PCR管用于分離體的接收。選擇合適的細胞數目或切割面積（如~2000μm2），在調節(jié)好相關參數（Power 49、Aperture 5、Speed 13、Bridge size 4）后開始進行切割（圖1）。切割完成后，小心將PCR管取出，由管底倒扣至管蓋蓋緊，防止管蓋中收集的樣品遺落。
圖1. 腦組織切片樣本用于激光顯微切割分離體制備。在40倍放大視野中選取合適的面積，約2000 μm2（左）進行切割分離并用于后續(xù)分析；一份樣品切割分離完成后（右），可繼續(xù)選擇其他區(qū)域進行操作。
樣品提?。?/strong>
裝有樣品的PCR管在vortex中振蕩5s，由點甩小型離心機將微量樣品離心至管底，小心打開管蓋，加入30 μL提取溶液（異丙醇:乙腈:水 30:65:5 v/v/v），振蕩混勻，超聲15 min，離心后將全部溶液轉移至進樣小瓶中待LC-MS/MS分析。LC-MS條件：樣品通過ExionLC™系統(tǒng)串聯SCIEX 7500系統(tǒng)，進行分析。數據通過SCIEX OS 軟件2.1中的定量功能進行處理。
分析結果
在分離的微量細胞中（組織切片約2000μm2），共檢測到285個脂質化合物，包括鞘脂SM、膽固醇酯CE、甘油三酯TAG、甘油二酯DAG、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰膽堿PC、神經酰胺Cer7類。
圖2.微量腦組織切片中測得的不同種類脂質化合物的數量。基于LC-MS/MS 的靶向脂質組學方法快速分析基質中的多種脂類物質。
圖3.對于微量細胞中檢測到的脂質化合物的判定，主要基于與空白提取溶劑（陰性對照）和血漿脂質提取樣本（陽性對照）共同比較，并且結合各類脂質標準品出峰位置情況、同類脂質化合物有較為接近的出峰位置，而同類脂質化合物連接脂肪酸鏈越長保留時間越靠后、連接相同碳數的脂肪酸鏈上不飽和鍵數越多保留時間越靠前的規(guī)律，對微量樣本中檢出的脂質化合物做定性判斷。
通過徠卡激光切割顯微鏡LMD7獲取微量樣本技術與SCIEX 7500 系統(tǒng)高靈敏度檢測相結合，實現微量細胞高覆蓋靶向脂質組學 PE（P-18:0_18:0）分析檢測。在約2000μm2 組織切片樣品中檢測到脂質化合物數目285個，符合組學分析對化合物覆蓋度的需求。
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