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在體外建立起可以準(zhǔn)確而完整模擬各種體內(nèi)器官生理學(xué)現(xiàn)象的是各位生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究者夢寐以求的目標(biāo)，而實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)的第一步需要得到可以無限增殖，并能分化成各種組織或器官的干細(xì)胞，其可以是從成體來源或者從胚胎來源，后者相較之前者具有全能分化能力。雖然胚胎干細(xì)胞是自然界可以直接獲取全能的細(xì)胞，但是獲取難度大而且使用可能會(huì)有倫理問題，但是隨著2006年誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）技術(shù)¹的問世這一問題得到很好的解決，可以讓研究人員選取任何體細(xì)胞進(jìn)行重編程后變成多能型的干細(xì)胞（PSC），然后分化成不同的成體干細(xì)胞，最后分化成各種體細(xì)胞模，特別是人多能干性（hPSC）可以用來分化成各種細(xì)胞，特別是無法出活體實(shí)驗(yàn)中得到的細(xì)胞。
解決了這個(gè)問題后，新的情況出現(xiàn)了，就是2D環(huán)境下培養(yǎng)出來的細(xì)胞往往只能貼壁在二維環(huán)境下生長，但是地球上的生命都是誕生和生長于三維環(huán)境中的，維度的缺失讓細(xì)胞間的相互作用力只存在XY軸，而沒有Y軸。此外，三維環(huán)境下多層細(xì)胞間的滲透效應(yīng)也缺失了。所以最終在傳統(tǒng)2D培養(yǎng)體系中細(xì)胞永遠(yuǎn)只能長成細(xì)胞，很多生理學(xué)功能無法實(shí)現(xiàn)，而且無法形成類似于組織和器官的結(jié)構(gòu)。由此，將有干性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在3D環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，使其最終能成為類似于正常組織和器官，或相應(yīng)部位腫瘤的類器官培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。常見的類器官培養(yǎng)方案的祖細(xì)胞來源是：成體干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，但是這種方法局限于通過活體實(shí)驗(yàn)獲取此類細(xì)胞，而且這一部分是必須在成體內(nèi)存在的，但是像心肌、腦這種無法在活體獲得成體干細(xì)胞的組織，就可以使用前面介紹的iPSC通過分化調(diào)控來獲取。在這個(gè)方面的之一是美國辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心的James M. Wells教授，他為iPSC培養(yǎng)消化系統(tǒng)相關(guān)類器官建立完整的技術(shù)流程。
在2017年他開始從PSC培養(yǎng)出了消化道的類器官²。讓建立體外人類器官模型更加方便，因?yàn)橐话銓?shí)驗(yàn)室是很難獲得人的手術(shù)樣本，同時(shí)也解決了手術(shù)獲取干細(xì)胞的異質(zhì)性問題；此外，還可以通過精確的分化調(diào)控產(chǎn)生出不同的細(xì)胞，如可以在培養(yǎng)胃底類器官時(shí)候，加BMP4處理48小時(shí)可以長出胃壁細(xì)胞³；最后，還因?yàn)閕PSC保留了宿主的全部基因序列（含突變）），所以可以模擬出各個(gè)組織因?yàn)檫z傳因素可能出現(xiàn)病變。但是這樣培養(yǎng)出來的類器官也有其缺陷，因?yàn)楫吘惯€是在培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，所以無法形成體內(nèi)的環(huán)境，如神經(jīng)系統(tǒng)的控制、循環(huán)系統(tǒng)對(duì)養(yǎng)分的更新，所以這些消化道的類器官不傳代的情況下能培養(yǎng)時(shí)間一般在2周，最長不過4周，而傳代就意味著類器官會(huì)被打散，因而造成其能生長的尺寸有限。而James M. Wells教授為此做出了兩個(gè)解決方案。其一是使用器官芯片技術(shù)，在這種微流控芯片中進(jìn)行培養(yǎng)，這樣可以通過芯片的腔室和外置蠕動(dòng)泵來模擬出體內(nèi)的循環(huán)，從而延長單代次生長時(shí)間，進(jìn)而更大，而且借助液流系統(tǒng)可以方便地控制加入藥物和各位微生物或病毒的濃度和時(shí)間，便于完成藥敏、藥代和感染實(shí)驗(yàn)⁴。其二是將培養(yǎng)過的類器官植入在免疫缺陷小鼠的體內(nèi)，讓其可以融合到小鼠的器官上，讓類器官可與宿主的神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)融合，不但可以讓其長得較之在培養(yǎng)皿中更大，可以達(dá)到近千倍，而在新文章中報(bào)道，這種植入的類器官在宿主體內(nèi)開始發(fā)育出布倫納氏腺這樣有分泌功能的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，從而這種升級(jí)版的類器官為讓其往這方面的應(yīng)用建立了基礎(chǔ)⁵。

   到這里，是不是大家對(duì)James M. Well教授的這套技術(shù)路線非常感興趣呢？但PSC實(shí)驗(yàn)流程很長，對(duì)分化節(jié)點(diǎn)的把握至關(guān)重要，因?yàn)榧?xì)胞的狀態(tài)瞬息萬變，如果涉及熒光染色和拍照可能會(huì)耽誤這些重要節(jié)點(diǎn)，從明場觀察到的活細(xì)胞的狀態(tài)下就進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)判斷非常重要，所以后續(xù)部分我們先就以胃類器官為例，將培養(yǎng)過程中涉及明場形態(tài)觀察的要點(diǎn)進(jìn)行介紹，具體操作步驟可以點(diǎn)擊此鏈接查看原文。
下圖中的明場圖像皆來自Leica-Microsystems的S APO體視鏡，其擁有復(fù)消色差（APO）鏡頭，可以實(shí)現(xiàn) 8:1 變倍比以及高達(dá) 80x 的強(qiáng)大放大能力，此類鏡頭適用于可見光譜及更大范圍內(nèi)高規(guī)格的應(yīng)用，可以讓您方便觀察和拍攝干細(xì)胞培養(yǎng)過程和分化結(jié)果。
 
 
hPSC-胃類器官（GOs）培養(yǎng)過程中明場圖像解析³：
整個(gè)技術(shù)流程如圖1所示，圖1a中介紹了整個(gè)流程需要34天，可以從hPSC分化培養(yǎng)成胃竇類器官（hAGOs）和人胃底類器官（hFGOs）。而這2種類器官在前6天（即：Day0-5）處理方式一樣，都是分化成后段前腸球體（posterior foregut spheroids），然后包埋到基質(zhì)膠中，進(jìn)行后續(xù)的處理。而前6天的步驟中，第一階段前3天需要加入Activin A和BMP4，讓hPSC分化成單層的定形的內(nèi)胚層（DE），其的標(biāo)記物是SOX17和FOXA2。而第二階段的3天需要添加Chiron、FGF4、Noggin和RA（第5天加入）形成3D懸浮的前腸球體，其的標(biāo)記物是HNF1β和SOX2。
然后將懸浮的前腸球體包埋進(jìn)基質(zhì)膠中，如果要培養(yǎng)出hAGOs需要添加EGF、Noggin和RA先處理3天，接下來用添加EGF處理3周。如果是培養(yǎng)hFGOs，則是用EGF、CHIR、Noggin和 RA處理3天。在培養(yǎng)體系中，Noggin作為BMP信號(hào)通路的抑制劑，可以啟動(dòng)前腸球體的發(fā)育；RA讓前腸發(fā)育成后部前腸，后者的標(biāo)記物是HNF1B和GATA4。在處理的3天中，經(jīng)典wnt信號(hào)通路的激活可以讓GOs形成胃底上皮，CHIR這個(gè)小分子可以起到該作用。在Day 9，胃底球體在含有CHIR和EGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在Day 20加入FGF10直到流程結(jié)束。在Day 30的時(shí)候需要降低EGF的濃度，這樣可以增加hAGOs和hFGOs中內(nèi)分泌細(xì)胞的數(shù)量。在Day 30 對(duì)hFGOs 進(jìn)行48小時(shí)的BMP4和PD032591處理可以刺激其產(chǎn)生胃壁細(xì)胞。
 
圖1 培育和分化流程。
 
 
圖2 | 第0-3天，觀察目標(biāo)hPSC細(xì)胞的適當(dāng)匯合度，以確保hPSC能分化為DE和穩(wěn)定生成后部前腸球狀體。 a. 細(xì)胞按不同比例進(jìn)行單細(xì)胞傳代后1天，hPSC的第0天圖像，三組圖片分別展示了低、目標(biāo)和過高的匯合度。a組上部分別是傳代后的hPSC在低倍放大的情況想下低的匯合度（左）、目標(biāo)匯合度（中）和過于密集的匯合度（右）。而a組下部依次是低的匯合度（左）、目標(biāo)匯合度（中）和過于密集的匯合度（右）。b. 第3天，在3天Activin A處理結(jié)束時(shí)，達(dá)到目標(biāo)匯度的DE細(xì)胞單層的低倍（頂部）和高倍（中間和底部）圖像。c. 第6天預(yù)期的球狀體生成低倍圖像，生成結(jié)果為差（左）、旺盛（中間）和中等（右）。a,b. 在圖像采集前更換培養(yǎng)基以去除細(xì)胞碎片。比例尺，1mm（a,b（頂部和中心），c）；250 μm（b，底部）。【注：因?yàn)橐ＷC各個(gè)圖像的亮度匹配，所以對(duì)a中頂部圖像的亮度進(jìn)行了調(diào)整。】
 
 
圖3 - 第4-20天，后前腸球狀體生成、hAGOs和hFGOs在基質(zhì)膠中生長相關(guān)的形態(tài)學(xué)變化。a. (上排)，第4天的低倍（左）和高倍（右）放大圖像，整個(gè)孔中出現(xiàn)了可以形成球狀體的單層細(xì)胞，表現(xiàn)為3D出芽形態(tài)。（中排）第5天，可以形成球狀體的單層細(xì)胞的低倍（左）和高倍（右）放大圖像，因?yàn)?D形態(tài)形成了許多貼壁的出芽球狀體和一些自由漂浮的球狀體。（下排）第6天的低倍（左）和高倍（右），可以形成球狀體的單層細(xì)胞（其中有大量可以進(jìn)行收集的自由漂浮球狀體），單層細(xì)胞基本上沒有3D出芽形態(tài)。b. 第6天，自由漂浮在培養(yǎng)基中的單個(gè)球狀體的高倍放大圖像。來自同一代的球狀體在形狀和大小上各不相同，但都被包被在基質(zhì)膠中以備將來生長。c. 在基質(zhì)膠中的胃竇和胃底球狀體在第9天（上排）、第13天（第二排）和第20天（第三排）長成hGO的低倍倍放大圖像。插圖顯示了基質(zhì)膠中單個(gè)球狀體的放大圖像。（下排）第20天高倍放大的hAGO和hFGO圖像，有大量非計(jì)劃的神經(jīng)生長（綠色箭頭）。在選擇hGO作進(jìn)一步培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)避免選擇這種hGO，以減少密度。比例尺，1 mm（a,c），250μm（b）。白色方框內(nèi)的插圖是5倍數(shù)字放大的圖像；插圖的寬度為~833μm（c）?！咀ⅲ簩?duì)c的上排圖像亮度進(jìn)行了調(diào)整，以使其與其他圖像的亮度匹配?！?/span>
 
 
圖4 – 降低了EGF濃度后，在基質(zhì)膠中生長的hGO中胃竇和胃壁細(xì)胞的狀態(tài)。 白色箭頭指示hAGO發(fā)育出的內(nèi)部腺體。黃色箭頭表示在hFGO中發(fā)育出外部腺體的出芽。綠色箭頭指示了一個(gè)在低EGF濃度下發(fā)育出來的神經(jīng)叢。a,b,在Day 24（上排）、27（中排）和34（下排），在基質(zhì)膠中生長的hAGO和hFGO的低倍（左）和高倍（右）放大圖像。a（下排），發(fā)育后的hAGO顯示有清晰的管腔和旺盛的內(nèi)部腺體。b（下排），發(fā)育后的hFGOs顯示有旺盛的外部腺體出芽，腔內(nèi)可能含有或不含有很多細(xì)胞碎片。比例尺，1 mm?！咀ⅲ簩?duì)下排圖像的亮度進(jìn)行了調(diào)整，以使其與其他圖像的亮度匹配?！?/span>
 
下一篇將會(huì)為大家?guī)眍愐浦?/span>到免疫缺陷小鼠的操作流程解析。
 
 
1. Kazutoshi Takahashi, Shinya Yamanaka. (2006). Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell 126, 663–676.
2. McCauley, H.A., and Wells, J.M. (2017). Pluripotent stem cell-derived organoids: using principles of developmental biology to grow human tissues in a dish. Development 144, 958–962.
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4. Kang Kug Leea. Et al. (2018) Human stomach-on-a-chip with luminal flow and peristaltic-like motility. Lab Chip 18(20): 3079–3085.
5. Alexandra K. Eicher. Et al. (2022) Functional human gastrointestinal organoids can be engineered from three primary germ layers derived separately from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 29, 36–51

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