圖 2。 概括了對含有多種熒光染料的樣本成像時的三種顏色分離方法。 通過比較發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)熒光成像方法相比，F(xiàn)luoSync 采集速度更快的優(yōu)勢顯而易見。FluoSync 捕捉受激發(fā)染料的全發(fā)射光譜，因此光子不會被浪費，這使它成為敏感活體樣本弱光成像的理想探測技術。
圖 3。 左側所示為藍色、綠色和紅色熒光團的三個單獨光譜。 使用相量分析時，每個純光譜都落入相量空間中的特定空間，顏色在一個圓圈上表示，信號清晰度決定了與中心（中間面板）的距離。 這些熒光團的任意組合也將落入特定空間。 圖中所示是三個熒光團中的每一個與所有三個熒光團的混合體的一種組合。 由于任何可能的熒光團組合也將落入“它們的"空間，因此可將光譜平均化以實現(xiàn)去噪。 右側圖是一個例子，其中黑線表示平均值 ± 誤差（顯示為灰色區(qū)域）。 降噪光譜表示所有貢獻熒光團的總和，它很好地填充了曲線下方的面積通過相量來表示光譜信息，可對圖像中的不同熒光組分進行實時、半盲的光譜分解。這種表示方法不僅局限于熒光標記，還可以去除自發(fā)熒光等無用信號，因此比線性拆分更加可靠。基于相量的光譜拆分方法適合用于分解最多 3 個熒光團的信號。超過 3 個熒光團時，相量方法仍然可以輕松識別最大的影響因素。拆分領域的新發(fā)展催生了一種混合拆分方法，它結合了基于相量的拆分和線性拆分這兩種方法的優(yōu)點。
對混合光譜拆分的說明
FluoSync 充分利用了基于相量的拆分與線性拆分混合方法的優(yōu)勢。相量分析用于相似光譜的快速聚類以及光譜去噪和線性拆分，能夠識別染料對每個聚類的單獨貢獻，甚至包括超過 3 種染料的情況（圖3）。與單純基于相量的拆分類似，具有相似熒光組分的所有像素都會落入相同的相量空間。因此，無論空間位置（即圖像中的原點位置）如何，它們都可被平均化以實現(xiàn)光譜去噪。 這樣，通過歧管進行的線性拆分操作次數(shù)（像素數(shù)，通常在百萬像素級別）通常會減到少于100,000次操作。然后對降噪光譜進行線性拆分，由此識別每種染料的亮度值。與線性方法相比，混合拆分方法利用了基于相量的方法所具有的速度和平均化優(yōu)勢，而不會影響可分離染料的數(shù)量。
總結與優(yōu)勢
FluoSync是光學濾色鏡的數(shù)字迭代進步。這是一種可用于對多種染料成像的可靠方法。由于它只需要單次圖像曝光，并且可以使用自動光譜分解方法完成，因此可以更輕松、更快速地進行多色熒光成像。
與傳統(tǒng)成像技術相比，F(xiàn)luoSync 提供了高速、同步的多通道采集，同時利用了串擾而不是避免串擾。它是掃描大型樣本或捕捉活細胞快速動態(tài)過程的理想解決方案。最后，使用 FluoSync 時無需在實驗之間管理多組熒光濾色塊，從而簡化了實驗工作流程。因此，您可以專注于獲得結果，而不是研究顯微鏡。
優(yōu)勢：
> 可使用不同的熒光團組合更加自由地進行多通道成像：您不再受限于使用與顯微鏡的固定濾光鏡組匹配的染料組合。
> 提升數(shù)據(jù)生成效率： 能同時采集所有事件而無需管理多組濾光鏡，從而加快了圖像采集過程，提高了對多孔板等大型樣本成像的效率，并且能夠捕捉活體樣本中的快
速事件。
> 增強信心：使用混合光譜拆分方法意味著您無需再擔心串擾。
參考資料
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F. Fereidouni, A. N. Bader, H. C. Gerritsen, Opt. Express 2012,20, 12729
Francesco Cutrale, Vikas Trivedi, Le A Trinh, Chi-Li Chiu, John MChoi, Marcela S Artiga & Scott E Fraser. 《自然·方法學》14,149–152 (2017)
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