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“一花一世界”，這句充滿禪意的話在微觀視野中得到詮釋。而構(gòu)成世間萬(wàn)千紛繁的原子由化學(xué)鍵聯(lián)合為分子，不同的分子往往具有特異性的化學(xué)鍵振動(dòng)，成為它們的指紋特征。相干拉曼散射（Coherent Raman Scattering，CRS）顯微術(shù)便是通過(guò)探測(cè)目標(biāo)分子的特征振動(dòng)來(lái)提供成像所需的襯度, 同時(shí)基于非線性光學(xué)過(guò)程大大增強(qiáng)拉曼散射的信號(hào)，提高成像速率以及檢測(cè)靈敏度的新型顯微技術(shù)^[1][2]。

▲水分子的三種振動(dòng)模式示意

▲圖 1.水稻花粉的受激拉曼顯微成像圖（紅：脂質(zhì)；綠：淀粉；藍(lán)：蛋白）[3]

常見(jiàn)的光譜學(xué)手段按躍遷類型可分為兩大類：電子光譜和振動(dòng)光譜。電子光譜涉及電子在不同能級(jí)間的躍遷（如吸收光譜和熒光光譜等）；振動(dòng)光譜則作用于化學(xué)鍵或聲子的振動(dòng)（如紅外吸收譜和拉曼散射譜）。如果把電子光譜比作靜如處子但威力強(qiáng)大的內(nèi)功；振動(dòng)光譜則好似動(dòng)如脫兔、招式鮮明的外家拳（見(jiàn)水分子振動(dòng)示意圖）。紅外譜為直接共振吸收，信號(hào)很強(qiáng)但波長(zhǎng)較長(zhǎng)（中遠(yuǎn)紅外），不利于含水環(huán)境的高分辨生物成像；我們通常講的拉曼散射指自發(fā)拉曼散射過(guò)程，信號(hào)非常弱（比熒光低 8-10 個(gè)數(shù)量級(jí)），無(wú)法用于快速成像。相干拉曼是增強(qiáng)拉曼的手段之一，利用短脈沖激光的非線性效應(yīng)實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)，具有*的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。

簡(jiǎn)單概括，相干拉曼散射顯微術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1. 免標(biāo)記和分子特異性：CRS 成像的信號(hào)來(lái)源于目標(biāo)分子本身，無(wú)需外源標(biāo)記物，也避開(kāi)了藥物小分子等不易標(biāo)記的問(wèn)題，在活體（in vivo）觀測(cè)上更具有優(yōu)勢(shì)；可對(duì)具有不同拉曼譜的分子進(jìn)行選擇性成像，比如生物樣品里常見(jiàn)的脂質(zhì)、蛋白、核酸和糖類等（如圖 1）；

2. 較高的探測(cè)靈敏度：相比于自發(fā)拉曼，成像速度一般有 3-5 個(gè)數(shù)量級(jí)的提升，一定條件下可實(shí)現(xiàn)視頻成像速度（每秒幾十幀）；

3. 光學(xué)層析和三維掃描：類似多光子顯微鏡的光學(xué)層析和三維成像功能；且由于所用的激發(fā)波長(zhǎng)一般在近紅外，有較好的穿透深度和更小的光毒性。

根據(jù)非線性光學(xué)過(guò)程的不同，可將相干拉曼散射分為兩種：相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering，CARS）和受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）。雖然這兩種非線性光學(xué)現(xiàn)象很早就被發(fā)現(xiàn)（上世紀(jì) 60 年代），但長(zhǎng)期僅作為光譜學(xué)測(cè)量手段，直到 1999 年以及 2008 年，哈佛大學(xué)謝曉亮教授才分別將它們以實(shí)用顯微成像技術(shù)推廣開(kāi)來(lái)^[4][5]。

▲圖 2. 自發(fā)拉曼散射、受激拉曼散射以及相干反斯托克斯拉曼散射的能級(jí)示意圖

自發(fā)與相干拉曼散射的能級(jí)示意圖見(jiàn)圖 2。自發(fā)拉曼只需要一束激發(fā)光，稱為泵浦光（ω_p），泵浦光子與分子發(fā)生非彈性碰撞，將部分能量轉(zhuǎn)移給分子振動(dòng)。因此散射出來(lái)的光相對(duì)于泵浦光將發(fā)生一系列的頻率紅移，稱為斯托克斯光（ω_s），對(duì)應(yīng)到光譜儀中的一系列譜峰，成為該分子的指紋特征。泵浦和斯托克斯光子的頻率差正好共振于化學(xué)鍵的振動(dòng)頻率（Ω=ω_p-ω_s），滿足能量守恒。對(duì)于相干拉曼散射，需將泵浦和斯托克斯這兩束激光同時(shí)作用于分子，當(dāng)它們的頻率差（拍頻）共振于某個(gè)化學(xué)鍵的振動(dòng)時(shí)，大量分子的同一個(gè)振動(dòng)模式將被同步（相干地）激發(fā)起來(lái)，使得散射效率得到大大地增強(qiáng)。終表現(xiàn)為：泵浦光減弱（受激拉曼損失，SRL）、斯托克斯光增強(qiáng)（受激拉曼增益，SRG），并且出現(xiàn)反斯托克斯（ωas=2ωp-ωs）的新頻率分量（CARS）。自發(fā)拉曼散射與熒光、吸收等同屬線性光學(xué)范疇，一般使用連續(xù)激光即可。相干拉曼與雙光子熒光、二次諧波等都屬非線性光學(xué)范疇，需使用超短脈沖激光。常見(jiàn)的用于相干拉曼的光源是皮秒光參量振蕩器（OPO），輸出兩路皮秒光，一束波長(zhǎng)固定（如 1064nm），另一束波長(zhǎng)在近紅外區(qū)間可調(diào)，它們分別作為斯托克斯和泵浦光。調(diào)節(jié)激光波長(zhǎng)使得我們可以改變待測(cè)拉曼頻率，選擇性地去探測(cè)不同的化學(xué)鍵/分子。

CARS 與 SRS 雖然都是三階非線性光學(xué)過(guò)程，它們之間有明顯的區(qū)別：CARS 是個(gè)四波混頻過(guò)程，產(chǎn)生的光子具有第三種頻率——反斯托克斯光子 ω_as，因此只需采用合適的濾波片就可以簡(jiǎn)單地提取出來(lái)；而 SRS 是泵浦和斯托克斯光之間的相互轉(zhuǎn)化過(guò)程，泵浦光子的湮滅和斯托克斯光子的產(chǎn)生同時(shí)發(fā)生，但沒(méi)有產(chǎn)生第三種光子；因此，通常用泵浦-探測(cè)技術(shù)中常見(jiàn)的調(diào)制解調(diào)的方式來(lái)提取信號(hào)，需要借助鎖相放大器來(lái)實(shí)現(xiàn)。CARS 顯微成像技術(shù)自 1999 年被發(fā)明以來(lái)，一直受困于非共振背景信號(hào)的干擾，典型的表現(xiàn)為光譜發(fā)生畸變（圖 3）。在苦苦求索了近 10 年之后，謝教授課題組于 2008 年推出了 SRS 技術(shù)，地解決了上述問(wèn)題。CARS 過(guò)程中能量被封鎖于電磁場(chǎng)/光子中，電子躍遷可繞過(guò)分子振動(dòng)直接通過(guò)虛能級(jí)產(chǎn)生；而 SRS 的發(fā)生依賴于光子能量與分子振動(dòng)之間的交換，具有嚴(yán)格的共振吸收特征。因此 SRS 在光譜上與自發(fā)拉曼一致（圖 3），在圖像上也不再受非共振背景的困擾（圖 4）。此外，SRS 的信號(hào)與分子濃度呈線性關(guān)系，更方便于定量解析復(fù)雜混合物體系中的各種化學(xué)成分。也因?yàn)檫@些特性，SRS 不斷獲得研究者們的青睞。

▲圖 3. 視黃醇在 1595cm^-1處的 Raman、CARS 與 SRS 的光譜對(duì)比 [5]

▲圖 4. CARS 與 SRS 對(duì)線蟲(chóng)內(nèi)脂質(zhì)成像 [6]

綜上，CARS 與 SRS 都可以基于生物體中核酸、脂質(zhì)和蛋白等物質(zhì)自身的 Amide I、CH2、CH3 等化學(xué)鍵進(jìn)行特異性成像。由于其免標(biāo)記、高分辨率、快速成像以及三維掃描的優(yōu)點(diǎn)，CRS 在病理檢測(cè)、生物代謝、藥物運(yùn)輸等方面具有廣泛應(yīng)用。具體的應(yīng)用部分將在下一課堂詳細(xì)講解。

下面讓我們先開(kāi)啟幾個(gè) CRS 的成像結(jié)果

▲圖 5. SRS 對(duì) Hela 細(xì)胞中的核酸、蛋白和脂質(zhì)進(jìn)行選擇性成像 [7]

▲圖 6. 小鼠腦腫瘤模型的受激拉曼成像。活體實(shí)驗(yàn)中，在（a）肉眼無(wú)法分辨腫瘤的區(qū)域；（b）受激拉曼技術(shù)可以清晰的探測(cè)到腫瘤邊界；（c）離體鼠腦切片的 SRS 圖像。藍(lán)色代表蛋白豐富的腫瘤區(qū)域 [8]