熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標記物所發(fā)出的熒光光譜的種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù),從各個角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。通過對這些參數(shù)的測定, 不但可以做般的定量分析, 而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化, 從而闡明分子結(jié)構(gòu)與能之間的關(guān)系。熒光分光光度計的激發(fā)波長掃描范圍般是190~650nm,發(fā)射波長掃描范圍是200~800nm??捎糜谝后w、固體樣品(如凝膠條、粉末)的光譜掃描。
構(gòu)成
1. 光源:
為壓汞蒸氣燈或氙弧燈,后者能發(fā)射出強度較大的連續(xù)光譜,且在300nm~400nm 范圍內(nèi)強度幾乎相等,故較常用。
2.激發(fā)單色器:
置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或*單色器,篩選出定的激發(fā)光譜。
3.發(fā)射單色器:
置于樣品室和檢測器之間的為發(fā)射單色器或二單色器,常采用光柵為單色器。篩選出定的發(fā)射光譜。
4. 樣品室:
通常由石英池(液體樣品用)或固體樣品架(粉末或片狀樣品)組成。測量液體時,光源與檢測器成直角安排;測量固體時,光源與檢測器成銳角安排。
5. 檢測器:
般用光電管或光電倍增管作檢測器??蓪⒐庑盘柗糯蟛⑥D(zhuǎn)為電信號。
基本原理
由壓汞燈或氙燈發(fā)出的紫外光和藍紫光經(jīng)濾光片照射到樣品池中,激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光,熒光經(jīng)過濾過和反射后,被光電倍增管所接受,然后以圖或數(shù)字的形式顯示出來。
物質(zhì)熒光的產(chǎn)生是由在通常狀況下處于基態(tài)的物質(zhì)分子吸收激發(fā)光后變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài), 這些處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的,在返回基態(tài)的過程中將分的能量又以光的形式放出,從而產(chǎn)生熒光.
不同物質(zhì)由于分子結(jié)構(gòu)的不同,其激發(fā)態(tài)能的分布具有各自不同的征,這種征反映在熒光上表現(xiàn)為各種物質(zhì)都有其征熒光激發(fā)和發(fā)射光譜;,因此可以用熒光激發(fā)和發(fā)射光譜的不同來定性地行物質(zhì)的鑒定。
在溶液中,當熒光物質(zhì)的濃度較低時,其熒光強度與該物質(zhì)的濃度通常有良好的正比關(guān)系,即IF=KC,利用這種關(guān)系可以行熒光物質(zhì)的定量分析,與紫外-可見分光光度法類似,熒光分析通常也采用標準曲線法行。