本篇繼上一篇“實(shí)用建議：“如何合理設(shè)計(jì)穩(wěn)定的凍干蛋白配方（一）"繼續(xù)為大家分享蛋白樣品凍干的理想賦形劑有哪些、基于成功蛋白凍干配方會導(dǎo)致Final失敗的一些細(xì)節(jié)問題等。

》》》對于蛋白樣品，理想的賦形劑有哪些？

從凍干對蛋白的所有危險(xiǎn)以及我們需要在各個(gè)環(huán)節(jié)考慮的所有因素來看，快速開發(fā)一個(gè)穩(wěn)定的蛋白配方看起來似乎是不可能的。幸運(yùn)的是，如果我們能夠采用合理的方法對配方進(jìn)行很好的設(shè)計(jì)，大多數(shù)的配方問題是可以得到快速解決。

這里，我們主要是對初始配方成分的選擇提供基礎(chǔ)。在一些情況下，初始的配方很有可能就是走向市場的Final產(chǎn)品。給定的組分，進(jìn)行不同微小的修改，已經(jīng)被成功地用于蛋白藥物。需要強(qiáng)調(diào)的是對于凍干配方，在能夠提供良好穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的情況下，成分越簡單越好。所加入的賦形劑都須要有數(shù)據(jù)證明對配方起有益的作用。

01給定蛋白質(zhì)維持穩(wěn)定性的具體條件

對于一些通用型的穩(wěn)定劑，可以有效地保護(hù)絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)，在選擇這些穩(wěn)定劑之前，我們有必要通過優(yōu)化影響蛋白物理和化學(xué)穩(wěn)定性的具體因素來選擇合適的穩(wěn)定劑。

影響蛋白物理和化學(xué)穩(wěn)定性的具體因素：

1. 避免偏激的pH值可以顯著降低蛋白脫氨基的幾率。而且，通過優(yōu)化溶液的pH值，可以顯著提高蛋白在凍干過程中抵抗去折疊的能力。

2. 還應(yīng)該研究其他能提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的特異性配體（通過增加去折疊的自由能）。肝素和其他聚陰離子對生長因子的穩(wěn)定性影響就是一個(gè)很好的例子。

3. 其它需要考慮的重要因素是離子強(qiáng)度對蛋白的去折疊和聚合的影響。須意識到，在預(yù)凍過程中，由于冰的形成將溶液濃縮，離子強(qiáng)度可增加50倍。因此負(fù)責(zé)原料藥純化和做藥物配方前研究的人員已經(jīng)對這些問題有了深刻的認(rèn)識，配方科學(xué)家應(yīng)該在著手設(shè)計(jì)凍干配方之前與他們進(jìn)行溝通。

即使在針對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性優(yōu)化的特定的溶液條件下，但是如果樣品需要幸免于凍干的損害并長期保存，有必要加入一些其它的保護(hù)劑。首先，我們考慮一些已經(jīng)用在凍干蛋白配方中的成分，但它們不能提供蛋白的穩(wěn)定性，而且可能會促進(jìn)蛋白在儲存期間的破壞。我們將提供一個(gè)簡單、有效的思路，并且討論選擇這些成分的原理。

02不能提供蛋白穩(wěn)定性的賦形劑

部分多聚物作為賦形劑的優(yōu)缺點(diǎn)

在凍干工藝的快速開發(fā)過程中，為了獲得一個(gè)強(qiáng)壯的蛋糕結(jié)構(gòu)，一些多聚物，如葡聚糖，氨基乙基乙醇胺淀粉，因具有較高的塌陷溫度，導(dǎo)致Final產(chǎn)品的Tg也會比較高，常常是受歡迎的賦形劑。

不好的是，這些多聚物在凍干過程中不能抑制蛋白結(jié)構(gòu)的去折疊，因此在后續(xù)的儲存中不能提供穩(wěn)定性。無法抑制凍干誘導(dǎo)變性的原因大概是聚合物過大而無法與蛋白質(zhì)氫鍵合，無法代替脫水過程中損失的水，或者是因?yàn)榫酆衔锱c蛋白質(zhì)形成了分離的無定形相。盡管當(dāng)這些多聚物單獨(dú)使用時(shí)不是一種很好的穩(wěn)定劑，但是經(jīng)證實(shí)，如果其結(jié)合雙糖穩(wěn)定劑可以具有較好好的作用。

凍干過程中的有效穩(wěn)定劑

對大量的化合物進(jìn)行測定，顯示在凍干過程在較有效的穩(wěn)定劑是雙糖，但是避免使用還原性糖。還原性糖在凍干過程中可以有效抑制蛋白結(jié)構(gòu)的去折疊，但是在干燥樣品的儲存過程中，可以通過美拉德反應(yīng)（糖的羰基和蛋白質(zhì)上的游離氨基）降解蛋白，結(jié)果形成含有降解蛋白的棕色糖漿，而不是含活性蛋白的白色蛋糕狀結(jié)構(gòu)。通常，我們減緩這個(gè)過程的方法是將樣品儲存在零度以下，這就失去了產(chǎn)品凍干的意義，這些還原性的糖包括：葡萄糖，乳糖，麥芽糖，麥芽糊精等。

在早期的研究中，晶體類的填充劑如甘露醇，甘氨酸在凍干過程中不能提供蛋白很好的穩(wěn)定性，但是，一些配方使用了這兩種物質(zhì)的混合物，并且成功地推向了市場。在這些案例中，甘露醇和甘氨酸適當(dāng)?shù)谋壤梢詫?dǎo)致一大部分的化合物保持無定形狀態(tài)。這部分無定形狀態(tài)的化合物足以抑制凍干過程中蛋白的去折疊并且提供長期儲存的穩(wěn)定性。但是建議謹(jǐn)慎選擇這種方法，因?yàn)檫_(dá)到合適的工藝條件再加上合適的賦形劑比例，既耗時(shí)又很難辦到的。

03賦形劑的合理選擇

如何合理的選擇賦形劑？

案例分享

舉個(gè)具體的案例說明，假設(shè)：

1. 蛋白藥物的濃度定在2mg/ml；

2. 主要的降解途徑是凍干后或復(fù)水后蛋白的聚合以及儲存期間蛋白的脫氨基；

3. 優(yōu)化具體的條件（如用檸檬酸鹽緩沖液控制pH為6）只能將凍干和復(fù)水后聚合程度降到10%，盡管樣品在低于Tg溫度的20℃下進(jìn)行儲存脫氨基速度仍然不能接受。加入晶體類的膨脹劑，如甘露醇，保持樣品強(qiáng)壯的結(jié)構(gòu)及良好的外觀。

在這種情況下，主要缺少的成分是非還原性雙糖，其在干燥樣品中會與蛋白形成無定形的結(jié)構(gòu)，作為主要的穩(wěn)定劑，主要選擇蔗糖或海藻糖。它們在預(yù)凍階段能夠很有效地保護(hù)蛋白并且能夠很好的抑制復(fù)水過程中蛋白結(jié)構(gòu)的去折疊。預(yù)凍階段的保護(hù)取決于初始糖的總濃度，有時(shí)，超過5%（w/t）的濃度可以盡可能大程度地保持蛋白的穩(wěn)定性。相反，在干燥階段，蛋白的保護(hù)取決于Final糖和蛋白的質(zhì)量比。一般來說，糖和蛋白的重量比至少為1:1時(shí)，可以提供較好的穩(wěn)定性，當(dāng)達(dá)到5:1時(shí)，可以達(dá)到很佳的穩(wěn)定性。保持蛋白的濃度不變，選取一定范圍的糖濃度進(jìn)行篩選和檢測，通過干燥樣品中天然結(jié)構(gòu)保留率以及復(fù)水后蛋白聚合降低的程度來確定最合適的濃度。

一般來說，合適的糖濃度，可以在凍干過程中提供蛋白很好的穩(wěn)定性，并且如果Final樣品的Tg高于儲存溫度，在后期的儲存期間也可以提供蛋白較好的穩(wěn)定性。例如，假定最高的儲存溫度為30℃，那么Final產(chǎn)品的Tg ＞50℃應(yīng)該是穩(wěn)定的，但前提是Final樣品的含水量需要達(dá)到允許的水平，因?yàn)樗值拇嬖跁档蜆悠返?/span>Tg?？梢允褂?/span>DSC檢測每種樣品的Tg值。

蔗糖/海藻糖如何選擇？

蔗糖和海藻糖，作為兩種常用的穩(wěn)定劑，均有其優(yōu)勢和劣勢，可根據(jù)不同的情況進(jìn)行選擇：

● 在任何水分含量的樣品中，海藻糖均會有較高的Tg，因此較為容易凍干。另外Tg ＞50℃的條件可以允許樣品有較高的殘留水分。然而，技術(shù)工程師應(yīng)該能夠針對這兩種雙糖設(shè)計(jì)經(jīng)濟(jì)有效的工藝。如果樣品中蛋白濃度較高，可以提高Tg，這樣就會弱化海藻糖的作用；

● 與蔗糖相比，海藻糖更能抵抗酸解，雙糖水解后會產(chǎn)生還原性的單糖，這是需要避免的。通常情況下，如果pH不是很低，如pH4左右或更低，這個(gè)應(yīng)該不是很大的問題；

● 蔗糖在凍干過程中抑制蛋白去折疊方面看似比海藻糖更有優(yōu)勢，當(dāng)?shù)鞍自陬A(yù)凍階段非常不穩(wěn)定（需要較高的糖濃度）和/或蛋白濃度較高時(shí)，這種優(yōu)勢更明顯。海藻糖的相對不穩(wěn)定性是由于在預(yù)凍和干燥過程中其更易于與蛋白之間產(chǎn)生相分離。對于給定的配方，這是否會有問題不能被預(yù)測，因此，每種制劑配方都需要檢查其保護(hù)蛋白的能力。

表面活性劑的作用

在這里，我們案例中的配方可能就比較完整了，就像許多蛋白質(zhì)的情況一樣。然而，我們假設(shè)，即使蔗糖全部抑制可檢測的蛋白質(zhì)去折疊，正如用紅外光譜對干燥固體的結(jié)構(gòu)分析所評估那樣，在復(fù)水后，仍然有1%的聚合蛋白。因?yàn)樵谠嫉臉悠分惺菦]有任何聚合的，假設(shè)在凍干過程中，一小部分蛋白發(fā)生了去折疊，在復(fù)水后，部分這些分子又重新折疊，但是部分聚合在一起。這個(gè)實(shí)際上看起來是個(gè)很普遍的問題，就像在凍干之前一些處理造成的聚合。幸運(yùn)的是，通過在配方中加入一些非離子型表面活性劑，如聚山梨醇酯（吐溫）通?？梢砸种频鞍椎木酆稀Ｒ蟮臐舛韧ǔ１容^低（＜0.5% w/v），通過將表面活性劑滴定到包含所有其它組分的凍干制劑中，可以識別出理想濃度。應(yīng)避免加入過量，因?yàn)楸砻婊钚詣┰谑覝叵率且后w的狀態(tài)，如果濃度較高，會降低配方的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度。然而，通常在優(yōu)化蛋白質(zhì)穩(wěn)定性所需的非常低的濃度下，不會有問題。

表面活性劑看作是畫龍點(diǎn)睛，通常在凍干產(chǎn)品配方中加入表面活性劑是有利的，可以抑制處理過程中界面引起的去折疊和聚集（如起泡夾帶或瓶-液界面引起的）。

最重要的是表面活性劑在凍干/復(fù)水過程中抑制聚合的能力，目前還不太清楚表面活性劑的保護(hù)在哪一步起作用的。有資料證明，表面活性劑在凍融及復(fù)水過程中可減少蛋白聚合并且在預(yù)凍階段有助于抑制蛋白的去折疊，對干燥固體中聚集物特定紅外波段的檢查表明，表面活性劑可以抑制凍干過程中產(chǎn)生的聚集。在復(fù)水過程中，曲折疊分子的聚合能通過表面活性劑得到抑制，猜測是通過分子之間的相互作用和/或作為一種潤濕劑，加速凍干產(chǎn)品的溶解。如果顯示表面活性劑在復(fù)水過程中是有益的，則可以通過在稀釋劑中加入表面活性劑來達(dá)到這種效果。

》》》還有哪些意想不到的危險(xiǎn)可能會導(dǎo)致失敗？

盡管根據(jù)上述給出的建議，對于給定蛋白，我們可以設(shè)計(jì)出成功的配方，但是，還有其他一些問題可能會導(dǎo)致Final失敗，特別是在長期儲存期間。

● 賦形劑中經(jīng)常會有一些污染物，這些會導(dǎo)致蛋白快速的化學(xué)降解，糖類和甘露醇中會含有過渡金屬元素，表面活性劑可能被過氧化物污染，所有的這些可以促進(jìn)蛋白的氧化；

● 在儲存過程中，水分從膠塞轉(zhuǎn)移到產(chǎn)品，引起水分參與的降解，直接損壞蛋白，并且降低蛋白的Tg,加速蛋白的降解，特別是當(dāng)儲存溫度高于Tg 時(shí)；

● 即使在高溫（如40℃）下的儲存穩(wěn)定性研究中，一切都表現(xiàn)出理想的狀態(tài)，但有一個(gè)常見的，但很少報(bào)道的事件可能是災(zāi)難性的，這個(gè)問題可以用下面的故事來說明。產(chǎn)品在實(shí)驗(yàn)室中在40℃下儲存可以保持幾個(gè)月的穩(wěn)定性，在冬季，產(chǎn)品在運(yùn)輸過程中也保持良好的穩(wěn)定性，沒有來自消費(fèi)者的問題報(bào)告，然而，有時(shí)在夏季，運(yùn)輸后，在室溫下儲存僅2周后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品過度降解，用差示掃描量熱儀DSC對一開始的干燥粉末進(jìn)行了檢查，給出了合理的解釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，制劑中的甘露醇沒有全部結(jié)晶，而是形成了Tg約為45℃的亞穩(wěn)玻璃態(tài)，當(dāng)在夏季運(yùn)輸過程中，超過了這個(gè)溫度時(shí)，甘露醇變發(fā)生結(jié)晶，最先與甘露醇結(jié)合的水被轉(zhuǎn)移到了剩余的無定形相中，蛋白相的水含量增加，降低了它的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，因此，加速了蛋白質(zhì)的降解。這個(gè)問題可以使用DSC設(shè)計(jì)合理的退火方案使甘露醇再預(yù)凍階段全部結(jié)晶來避免，另外也可以通過調(diào)整甘露醇的濃度，降低殘留水分含量，使甘露醇即使在45℃的條件下也不會結(jié)晶。

》》》對于給定的蛋白藥物，這些信息足夠嗎？

對于大多數(shù)的蛋白，上面給出的建議一般會設(shè)計(jì)出成功的配方，但是，每種蛋白都有其自有的的物理化學(xué)特性和穩(wěn)定性要求。因此，針對每種不同的蛋白，配方也需要自定義設(shè)計(jì)。結(jié)合蛋白本身的特性知識以及選擇合理的賦形劑可以快速設(shè)計(jì)出穩(wěn)定的凍干蛋白配方。

最后，在快速凍干工藝中保持干物質(zhì)的物理性質(zhì)和在干燥后獲得天然的蛋白質(zhì)之間需要折衷，研究表明：當(dāng)蔗糖結(jié)合葡聚糖一起使用時(shí)，由于蔗糖的作用，蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)可以保留在干燥的固體中；葡聚糖的存在提高了制劑的Tg，并提供了一種無定形的填充劑，快速干燥的同時(shí)保留了所需的蛋糕性質(zhì)；其他的一些聚合物有可能提供與葡聚糖相同的優(yōu)勢，如氨基乙基乙醇胺淀粉也具有較高的Tg，通常比葡聚糖更容易接受用于腸胃外給藥。期望可以合理地利用這些多聚物作為Tg的調(diào)節(jié)劑，使得制劑更穩(wěn)定，更容易快速凍干。

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譯自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》  John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997

* 如有理解錯(cuò)誤之處，還請參考原文

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