一.背景：
被曝光違規(guī)喂食金剛烷胺、利巴韋林等抗病毒藥品的“速生雞”流入市場，對多家餐飲企業(yè)都產(chǎn)生非常大的負(fù)面影響。利巴韋林又名病毒唑、三氮唑核苷、尼斯可等，是廣譜強(qiáng)效的抗病毒藥物，目前廣泛應(yīng)用于病毒性疾病的防治。利巴韋林通常會抑制谷胱甘肽，從而影響紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，使氧的紅血球細(xì)胞溶解，從而可能引起貧血，這也可能惡化已經(jīng)存在的心臟疾病，另外經(jīng)動物實驗證明利巴韋林還有致畸性、致癌性和生殖毒性等。
鑒于利巴韋林會在動物組織中有殘留，所以政府有關(guān)部門開始禁止使用利巴韋林等防治高致病性禽流感等一類病原微生物引起的病毒性疫病。我國對于動物源性食品中利巴韋林殘留含量的相關(guān)研究報道屬于空白，也未曾制定或立項過國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，上也無特定*及相應(yīng)檢測方法。而且經(jīng)多方面驗證目前還沒有準(zhǔn)確合適的檢測方法。
利巴韋林是弱堿性的極性小分子，易溶于水，所以本實驗采用水和乙腈的混合溶液提取雞肉中的利巴韋林。經(jīng)實驗證明，離子交換類填料對其吸附不穩(wěn)定，所以本實驗采用MAS-QuChERS方法進(jìn)行凈化處理，利用MAS填料直接吸附雞肉提取液中的雜質(zhì)，利用LC-MS/MS檢測技術(shù)建立了動物源性食品中的利巴韋林的快速檢測方法。

化合物名稱	英文名	結(jié)構(gòu)式	CAS編號
利巴韋林	Ribavirin Granules		36791-04-5

二.實驗部分

2.1儀器與試劑
API 4000+質(zhì)譜檢測器，配液相色譜儀；高速離心機(jī)；渦旋振蕩混合儀；超聲波振蕩器；氮氣濃縮儀。
利巴韋林MAS凈化管；利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）。甲醇、乙腈 （色譜純，博納艾杰爾科技）、甲酸（色譜級）、實驗用水為超純水；一次性無菌注射器（博納艾杰爾科技）；針式過濾器（0.22μm，直徑13mm博納艾杰爾科技）。
2.2 溶液的配制
標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品適量，用超純水溶解并定容配制成1mg/mL。
標(biāo)準(zhǔn)工作液：用超純水稀釋至合適濃度。
2.3 樣品的提取和凈化
酶解前處理方法：準(zhǔn)確稱取1g（至0.01g）均質(zhì)好的雞肉至 50 mL 離心管中，加入5mL10mmol/L乙酸銨溶液（pH=4.8）和20ul磷酸酯酶，渦旋混合2min，于37℃下酶解2h，取出冷卻至室溫，8000r/min離心5min，取全部上清液加入10ml乙腈，渦旋1min后8000r/min離心5min，取5mL上清液加入MAS凈化管中，渦旋1min后8000r/min離心5min，取全部上清液于50℃氮氣吹干后，用1mL水復(fù)溶過0.22μm濾膜，待測。
2.4 樣品的檢測
2.4.1 色譜條件
色譜柱：Venusil MP C18（2.1*150mm，5μm，100Å）；
流動相：0.1%甲酸水溶液-甲醇=95:5
流速：200μL/min；
柱溫：30℃；
進(jìn)樣量：5μL；
2.4.2 質(zhì)譜條件
電離模式：電噴霧電離正模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度（TEM）：550℃，Curtian Gas: 10，Ion Source Gas 1: 70，Ion Source Gas 2:75
表1 質(zhì)譜參數(shù)

化合物	保留時間/min	Q1	Q3	Decluster Potential	Collision Energy
利巴韋林	3.36	245.4	113.0	53	39
			96.2	53	13

下劃線表示定量離子
2.5 實驗結(jié)果
2.5.1 方法線性關(guān)系和定量限
分別添加利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)溶液至均質(zhì)好的雞肉中，使其形成濃度分別為5ug/kg、10ug/kg、20ug/kg、50ug/kg、100ug/kg的基質(zhì)添加樣品，在通過2.2所述方法提取凈化后檢測，以檢測得到的峰面積，以樣品添加濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)擬合其線性方程，按照S/N=10計算得到該方法的zui低定量限。

物質(zhì)名稱	回歸方程	相關(guān)系數(shù)	zui低定量限（S/N=10）
利巴韋林	Y=2285.5x-1991.5	0.9984	5ug/kg

表2 線性和檢出限

圖1 10ug/kg標(biāo)準(zhǔn)品譜圖
2.5.2 方法的穩(wěn)定性
在均質(zhì)好的雞肉中添加利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品溶液使其形成10ug/kg的基質(zhì)添加樣品，按照上述方法在相同的條件下檢測，按照測得的利巴韋林的出峰時間及峰面積的值計算該方法的穩(wěn)定性。
表3 方法穩(wěn)定性

編號	1	2	3	4	5	RSDn=5 ，%
保留時間（min）	3.43	3.41	3.43	3.41	3.39	0.49
峰面積	23384	21983	22346	23155	24198	1.39

圖2 10ug/kg雞肉加標(biāo)譜圖
2.5.3 準(zhǔn)確度與精密度
以均質(zhì)好的空白凈化后溶液加標(biāo)實驗證明該方法基質(zhì)對目標(biāo)物檢測存在影響，所以在實際樣品檢測過程中，以空白凈化后溶液加標(biāo)為基礎(chǔ)計算樣品添加的回收率。
分別在均質(zhì)好的雞肉中添加利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品溶液使其分別稱為含有5ug/kg和20ug/kg的基質(zhì)添加樣品，按照上述方法凈化、檢測后，測得的該方法的準(zhǔn)確性結(jié)果如下。
表4 基質(zhì)添加實驗結(jié)果與穩(wěn)定性

添加濃度	1	2	3	RSDn=3
5ug/kg	78%	87%	95%	9.6%
20ug/kg	75%	70%	79%	6.0%